Ανασύσταση πεπτιδίων: πώς γίνεται βήμα βήμα στο εργαστήριο

Σύντομη απάντηση: Η ανασύσταση πεπτιδίων είναι η διάλυση της λυοφιλοποιημένης σκόνης σε μετρημένο όγκο διαλύτη, ώστε να προκύψει διάλυμα γνωστής συγκέντρωσης. Αφήνετε το φιαλίδιο να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου, προσθέτετε αργά τον διαλύτη στο τοίχωμα, όχι πάνω στη σκόνη, και ανακινείτε απαλά με περιστροφή χωρίς να χτυπάτε. Ο διαλύτης είναι συνήθως βακτηριοστατικό νερό ή, για πεπτίδια που διαλύονται δύσκολα, αραιό οξικό οξύ.

Τα περισσότερα ερευνητικά πεπτίδια φτάνουν ως ξηρή σκόνη, συχνά ένα λεπτό, σχεδόν αόρατο στρώμα στον πάτο του φιαλιδίου. Πριν από οποιαδήποτε μέτρηση πρέπει να ξαναγίνουν διάλυμα. Ο τρόπος που θα γίνει αυτό επηρεάζει και το πόσο καλά θα διαλυθεί το πεπτίδιο και το πόσο σταθερό θα μείνει.

Τι είναι η ανασύσταση πεπτιδίων;

Ανασύσταση σημαίνει ότι προσθέτετε μετρημένο όγκο διαλύτη σε λυοφιλοποιημένη (ξηραμένη με ψύξη) σκόνη, ώστε να επιστρέψει σε υγρή μορφή με γνωστή συγκέντρωση. Δύο πράγματα μετράνε σε αυτό το βήμα:

• Διαλυτότητα: θα διαλυθεί πλήρως η ένωση;
• Σταθερότητα: θα μείνει ακέραιη μέσα στο διάλυμα;

Κάθε πεπτίδιο συμπεριφέρεται διαφορετικά, γι' αυτό στον πάγκο του εργαστηρίου υπάρχουν περισσότεροι από ένας διαλύτες.

Ποιον διαλύτη διαλέγετε;

Βακτηριοστατικό νερό

Το βακτηριοστατικό νερό 10 ml είναι στείρο νερό με 0,9% βενζυλική αλκοόλη ως συντηρητικό. Το συντηρητικό περιορίζει την ανάπτυξη βακτηρίων όταν το ίδιο φιαλίδιο ανοίγεται πολλές φορές, ενώ το απλό στείρο νερό δεν δίνει τέτοια προστασία. Το pH του είναι σχεδόν ουδέτερο και ταιριάζει σε πολλά πεπτίδια, γι' αυτό είναι η συνηθισμένη πρώτη επιλογή για ενώσεις που διαλύονται εύκολα στο νερό. Φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου, 15 έως 25 °C.

Οξικό οξύ 0,6%

Το οξικό οξύ 0,6% (αιθανοϊκό οξύ), 10 ml δημιουργεί ήπια όξινο περιβάλλον. Ορισμένα πεπτίδια, κυρίως όσα κολλάνε, συσσωματώνονται ή διαλύονται δύσκολα σε ουδέτερο pH, διαλύονται πιο εύκολα σε ήπια όξινες συνθήκες. Το οξικό οξύ χρησιμοποιείται λοιπόν ως βοήθημα διάλυσης και όχι ως προεπιλογή. Φυλάσσεται κι αυτό σε θερμοκρασία δωματίου.

Ο κανόνας που μετράει περισσότερο

Ο πιο αξιόπιστος οδηγός για κάθε πεπτίδιο είναι η σημείωση ανασύστασης στο πιστοποιητικό ανάλυσης ή στην τεκμηρίωση της παρτίδας. Εκεί αναφέρεται αν χρειάζεται νερό, βακτηριοστατικό νερό ή αραιό οξύ. Όχι ένας γενικός κανόνας, αλλά το προφίλ διαλυτότητας της συγκεκριμένης ένωσης.

Ανασύσταση πεπτιδίων βήμα βήμα

1. Προετοιμασία. Διαβάστε την τεκμηρίωση της παρτίδας, διαλέξτε τον διαλύτη και υπολογίστε τον όγκο που θα προσθέσετε. Ετοιμάστε καθαρή επιφάνεια εργασίας και ετικέτα.
2. Θερμοκρασία δωματίου. Αφήστε το κλειστό φιαλίδιο να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου πριν το ανοίξετε. Αν ανοίξετε κρύο φιαλίδιο, η υγρασία του αέρα συμπυκνώνεται πάνω στη σκόνη και επιταχύνει την αποικοδόμηση.
3. Μέτρηση του διαλύτη. Μετρήστε τον όγκο με βαθμονομημένη πιπέτα ή σύριγγα εργαστηρίου. Οι όγκοι μετριούνται, δεν εκτιμώνται, γιατί από αυτούς εξαρτάται η τελική συγκέντρωση.
4. Αργή προσθήκη στο τοίχωμα. Ρίξτε τον διαλύτη αργά πάνω στο εσωτερικό τοίχωμα του φιαλιδίου, όχι κατευθείαν στη σκόνη.
5. Απαλή ανάδευση. Περιστρέψτε το φιαλίδιο απαλά. Μην το χτυπάτε και μην το βάζετε σε vortex: η έντονη μηχανική καταπόνηση μπορεί να βλάψει ευαίσθητες πεπτιδικές αλυσίδες. Αν χρειάζεται, αφήστε το λίγα λεπτά να διαλυθεί μόνο του.
6. Οπτικός έλεγχος. Το διάλυμα πρέπει να είναι διαυγές. Θολούρα ή σωματίδια που δεν διαλύονται δείχνουν συνήθως ότι ο διαλύτης δεν ταιριάζει στη συγκεκριμένη αλληλουχία.
7. Ετικέτα. Γράψτε ένωση, συγκέντρωση, διαλύτη και ημερομηνία. Χωρίς αυτά τα τέσσερα, ένα αποτέλεσμα δεν ερμηνεύεται αργότερα.
8. Κλάσματα και ψυγείο. Μοιράστε το διάλυμα σε μικρά κλάσματα (aliquots), φυλάξτε το στο ψυγείο και προστατέψτε το από το φως.

Πόσο διαλύτη προσθέτετε;

Ο όγκος ορίζει τη συγκέντρωση: συγκέντρωση = μάζα ÷ όγκος. Αν διαλύσετε 10 mg σε 2 ml, έχετε 5 mg/ml, δηλαδή 5 μg σε κάθε μl. Αν θέλετε συγκεκριμένη συγκέντρωση, διαιρείτε τη μάζα με αυτήν: για 10 mg και στόχο 4 mg/ml χρειάζεστε 2,5 ml. Λυμένα παραδείγματα και αραιώσεις θα βρείτε στον οδηγό για τον υπολογιστή πεπτιδίων.

Πώς αποθηκεύετε το διάλυμα μετά την ανασύσταση;

Μόλις ένα πεπτίδιο διαλυθεί, γίνεται πολύ λιγότερο σταθερό απ' ό,τι ως ξηρή σκόνη. Το νερό συμμετέχει άμεσα στις κύριες αντιδράσεις αποικοδόμησης, όπως η υδρόλυση και η απαμίδωση, και τα διαλυμένα μόρια μπορούν να συσσωματωθούν ή να κολλήσουν στα τοιχώματα. Γι' αυτό:

• ανασυστήνετε μόνο την ποσότητα που χρειάζεστε για την τρέχουσα εργασία,
• κρατάτε το διάλυμα στο ψυγείο, μακριά από το φως,
• το χρησιμοποιείτε μέσα στο διάστημα σταθερότητας που ορίζει η τεκμηρίωση της παρτίδας,
• αποφεύγετε τους επαναλαμβανόμενους κύκλους κατάψυξης και απόψυξης, που ευνοούν τη συσσωμάτωση.

Η σκόνη που δεν έχει ανασυσταθεί φυλάσσεται στους 2 έως 8 °C για συνηθισμένα διαστήματα ή στην κατάψυξη, στους −20 °C και χαμηλότερα, για μεγαλύτερη διάρκεια, πάντα μακριά από το φως και με το πώμα σφραγισμένο.

Τι αλλάζει από πεπτίδιο σε πεπτίδιο;

Η διαδικασία είναι ίδια, οι λεπτομέρειες όχι. Το GHK-Cu, για παράδειγμα, δίνει διάλυμα με ελαφρώς μπλε απόχρωση λόγω του χαλκού, και αυτό είναι αναμενόμενο. Στα μείγματα, όπως το BPC-157/TB-500, όλα τα συστατικά διαλύονται μαζί στον ίδιο όγκο. Πεπτίδια που περιέχουν μεθειονίνη, κυστεΐνη ή τρυπτοφάνη είναι πιο ευαίσθητα στην οξείδωση, οπότε θέλουν ακόμη μεγαλύτερη προσοχή στον χρόνο που μένουν σε διάλυμα.

Ποια λάθη χαλάνε την ανασύσταση;

• Άνοιγμα του φιαλιδίου αμέσως μόλις βγει από το ψυγείο.
• Νερό ριγμένο με δύναμη κατευθείαν πάνω στη σκόνη.
• Δυνατό χτύπημα για να «διαλυθεί πιο γρήγορα».
• Διαλύτης διαφορετικός από αυτόν που ορίζει η τεκμηρίωση.
• Φιαλίδιο χωρίς ετικέτα ή χωρίς ημερομηνία.

Η ποιότητα του αποτελέσματος ξεκινά από την ποιότητα της σκόνης. Κάθε παρτίδα της PureChems ελέγχεται με HPLC και φασματομετρία μάζας από ανεξάρτητο εργαστήριο, με καθαρότητα ≥99%, και έχει το δικό της πιστοποιητικό ανάλυσης.

Συχνές ερωτήσεις

Βακτηριοστατικό νερό ή οξικό οξύ για την ανασύσταση πεπτιδίων;

Εξαρτάται από το πεπτίδιο. Όσα διαλύονται εύκολα στο νερό ανασυστήνονται συνήθως με βακτηριοστατικό νερό. Όσα κολλάνε ή διαλύονται δύσκολα, συχνά διαλύονται καλύτερα σε αραιό οξικό οξύ. Ακολουθήστε την τεκμηρίωση της παρτίδας.

Γιατί δεν ανακινούμε δυνατά το φιαλίδιο;

Επειδή η έντονη μηχανική καταπόνηση μπορεί να βλάψει τις πεπτιδικές αλυσίδες και να ευνοήσει τη συσσωμάτωση. Η απαλή περιστροφή αρκεί.

Πόσο διαρκεί ένα πεπτίδιο μετά τη διάλυση;

Δεν υπάρχει ένας αριθμός για όλα. Εξαρτάται από την αλληλουχία, τον διαλύτη και τη θερμοκρασία. Το διάλυμα κρατιέται στο ψυγείο και χρησιμοποιείται μέσα στο διάστημα που ορίζει η τεκμηρίωση της παρτίδας.

Μπορώ να καταψύξω το ανασυσταμένο πεπτίδιο;

Αν το πρωτόκολλό σας το προβλέπει, μοιράστε πρώτα το διάλυμα σε μικρά κλάσματα, ώστε κάθε κλάσμα να ξεπαγώνει μία μόνο φορά.

Τι κάνω αν το διάλυμα θολώσει;

Η θολούρα δείχνει συνήθως ότι η ένωση δεν διαλύθηκε πλήρως ή ότι ο διαλύτης δεν ταιριάζει. Ελέγξτε την τεκμηρίωση της παρτίδας για τον προτεινόμενο διαλύτη πριν συνεχίσετε.

Αποκλειστικά για ερευνητική χρήση. Δεν προορίζεται για ανθρώπινη ή ζωική κατανάλωση.