Peptid tárolása és stabilitása: laboratóriumi útmutató

Röviden: A peptid tárolása a forma szerint eltér. A liofilizált port lezárt fiolában, fénytől és nedvességtől védve tárolják: rövidebb ideig 2–8 °C-on, hosszabb távon -20 °C-on vagy hidegebben. A feloldott peptid jóval kevésbé stabil, ezért hűtve, alikvotokra osztva tartják, és kerülik az ismételt fagyasztást és felolvasztást. A mérvadó mindig a tétel COA-ján szereplő tárolási feltétel.

A tárolás a peptidkísérletek legkevésbé látványos változója, mégis az egyik leggyakoribb oka annak, hogy egy eredmény nem ismételhető meg. Egy fiola, amely meleg futárhálózaton utazott, önleolvasztó fagyasztóban állt, vagy hónapokig fénycső alatt a laborasztalon, kémiailag már nem azonos azzal, amit a COA leír. Ez az útmutató összefoglalja, mit mond a stabilitási szakirodalom, és hogyan érdemes a gyakorlatban tárolni.

Mit jelent a peptid stabilitása?

A stabilitás nem egyetlen tulajdonság, hanem két külön mért kérdés:

• Kémiai stabilitás: ép-e a kovalens szerkezet, vagyis nem változtatta-e meg az aminosav-sorrendet hidrolízis, oxidáció, dezamidálás vagy a diszulfidhidak átrendeződése.
• Fizikai stabilitás: a molekula a kívánt állapotban van-e, vagyis nem aggregálódott, nem tapadt a fiola falára, nem csapódott ki, és nem omlott össze a liofilizált „pogácsa”.

A kettő elválhat egymástól. Egy minta átmehet a tömegspektrometriás azonosításon, miközben jelentős része már aggregálódott, és oldatban nem érhető el. Ezért a stabilitási vizsgálatok jellemzően fordított fázisú HPLC-t párosítanak méretkizárásos HPLC-vel vagy gélelektroforézissel.

Mi rontja a peptidet tárolás közben?

A szakirodalom ugyanazokat a tényezőket emeli ki újra és újra:

• Hőmérséklet: a lebomlás sebessége a hővel meredeken nő. Ezen alapul a gyorsított stabilitásvizsgálat is.
• Víz: a hidrolízishez és a dezamidáláshoz víz kell, ezért a liofilizált por maradék nedvességtartalmát rendszeresen mérik.
• Fény: a szárított peptidek és fehérjék fény hatására is bomlanak, a fényzáró másodlagos csomagolás ezt visszaszorítja.
• Szekvencia: a metionin, a cisztein és a triptofán oxidációra hajlamos, az aszparagin-glicin motívum klasszikus dezamidálási pont. Az érzékenység tehát peptidenként eltér.
• pH és puffer: az oldott peptid stabilitása erősen pH-függő, és azonos pH mellett a puffer típusa is számít.
• Segédanyagok: a trehalózt, a szacharózt és a mannitot liofilizálást védő anyagként vizsgálják.
• Fagyasztás és felolvasztás: a jégképződés határfelületeket hoz létre, amelyek elősegítik az aggregációt.

Mit mutat a szakirodalom?

A peptidek stabilitásáról szóló formális vizsgálatok többsége a gyógyszer-formuláció területéről származik, nem egy-egy kutatási vegyületről. A közös megállapítás: a liofilizált, száraz állapot sokkal elnézőbb, mint az oldat, és a hőmérséklet, a fény, a maradék nedvesség és a segédanyagok választása a meghatározó.

Santana és munkatársai 2015-ben egy fagyasztva szárított rekombináns humán epidermális növekedési faktor formuláció teljes stabilitási programját közölték. 24 hónap 2–8 °C-on, illetve 6 hónap 25 °C-on és 60%-os relatív páratartalom mellett sem találtak jelentős lebomlást vagy fizikai változást. Ugyanez a vizsgálat azt is leírta, hogy a szárított por csak az elsődleges csomagolásban fényérzékeny volt, a másodlagos kartondoboz ezt teljesen kivédte.

Krishnan és munkatársai 2017-ben a CD101 nevű vegyületnél liofilizált porként 40 °C-on, 9 hónap alatt 2% alatti lebomlást írtak le, miközben vizes pufferekben jóval rövidebb stabilitási időt mértek. Ez jól mutatja, mennyi védelmet ad a víz eltávolítása.

A liofilizált peptid tárolása

• Hőmérséklet: rövidebb ideig hűtőben, 2–8 °C-on, hosszabb tárolásra fagyasztva, -20 °C-on vagy hidegebben. Viszonyítási pont mindig a COA-n szereplő feltétel.
• Fény: a fiolát tartsa a külső dobozában vagy fényzáró tárolóban.
• Zárás: a sértetlen gumidugó és kupak az elsődleges védelem a nedvesség és az oxigén ellen. Csak akkor bontsa fel, amikor szükség van rá.
• Felbontás előtt: hagyja a fiolát szobahőmérsékletűre melegedni. A hideg fiola kinyitásakor lecsapódó pára épp azt a vizet juttatja a porra, amelyet a száraz tárolás kizár.

A feloldott peptid tárolása

• Az oldat jóval kevésbé stabil, mint a száraz por, ezért rövid életű, hűtve tartott munkaoldatként kezelik.
• Alikvotokra osztják, ahelyett hogy ugyanazt a fiolát nyitogatnák. Így kevesebb a fagyasztási ciklus és a levegővel való érintkezés.
• Rögzítik az oldószert, a koncentrációt, a feloldás dátumát és a tárolási hőmérsékletet. E négy adat nélkül egy későbbi tisztasági eredmény nem értelmezhető.
• Az oldószer is számít, mert a pH és a tartósítószer eltér. Részletek: bakteriosztatikus víz vagy ecetsav, a feloldás menete pedig a peptid feloldásáról szóló útmutatóban.

Tárolás egy táblázatban

Forma	Tárolás	Megjegyzés
Liofilizált por, rövidebb ideig	2–8 °C, fénytől védve	lezárt fiola, külső dobozban
Liofilizált por, hosszabb távon	-20 °C vagy hidegebb	felbontás előtt szobahőmérsékletre melegíteni
Feloldott oldat	2–8 °C, rövid ideig	felcímkézve, a stabilitási időn belül
Feloldott oldat, hosszabb távon	alikvotokra osztva, fagyasztva	egy alikvot, egy felolvasztás
Bakteriosztatikus víz, bontatlanul	15–25 °C	szennyeződéstől védve

Önleolvasztó fagyasztó: miért számít?

Az önleolvasztó (frost-free) fagyasztó szándékosan ciklikusan változtatja a hőmérsékletet, hogy ne képződjön jég. Hosszú távú tárolásra ezért nem egyenértékű a kézi leolvasztású készülékkel. Ha önleolvasztó fagyasztót használ, ezt is érdemes feljegyezni, a hőmérséklet-kilengésekkel együtt.

Dokumentáció átvételkor

• Jegyezze fel, milyen állapotban érkezett a csomag.
• Tartsa a COA-t a tételszám mellett, ne külön, így a tisztasági adat mindig a tárolási előzményekkel együtt olvasható.
• Rögzítse a tételszámot, a HPLC tisztaságot és a COA-n megadott tárolási feltételt. Hogy mit jelentenek ezek az adatok, a COA tanúsítvány olvasásáról szóló cikk magyarázza el.

Példák a PureChems kínálatából

A BPC-157 10 mg és a Semax 10 mg liofilizált porként, lezárt üvegfiolában érkezik, az adatlap szerint mindkettőt 2–8 °C-on, fénytől védve tárolják. A bakteriosztatikus vizet bontatlanul szobahőmérsékleten tartják. Minden termék tisztasága legalább 99%, amelyet független laboratórium igazol HPLC- és tömegspektrometriás vizsgálattal, és minden gyártási tételhez COA tartozik. A csomagot diszkréten, nyomkövetéssel adjuk fel az EU-n belülről.

Gyakori kérdések a peptid tárolásáról

Meddig stabil a liofilizált peptid?

Nincs egyetlen válasz, mert a szekvenciától, a formulációtól és a tárolási feltételtől függ. Fagyasztva szárított peptid- és fehérjeformulációk közölt stabilitási programjai 12–24 hónapos épséget írtak le 2–8 °C-on, szobahőmérsékleten rövidebbet. Az adott tételnél a COA-n szereplő feltétel és újravizsgálati dátum a mérvadó.

Miért kevésbé stabil a peptid oldatban?

Mert a víz közvetlenül részt vesz a fő kémiai lebomlási folyamatokban, a hidrolízisben és a dezamidálásban. Oldatban a molekulák ráadásul szabadon aggregálódhatnak és a fiola falára tapadhatnak.

Árt a peptidnek az ismételt fagyasztás és felolvasztás?

Igen, ez a formulációs vizsgálatok standard terhelési körülménye, mert a jégképződés elősegíti az aggregációt. Ezért osztják alikvotokra a munkaoldatot.

Hűtő vagy fagyasztó: melyik a jobb?

A tervezett tárolási időtől függ. Ha a port hamarosan felhasználják, a 2–8 °C-os hűtő elég. Ha hónapokig áll, a -20 °C-os vagy hidegebb, lehetőleg kézi leolvasztású fagyasztó a biztonságosabb. A COA-n szereplő feltétel mindkét esetben elsőbbséget élvez.

Tárolható a liofilizált peptid szobahőmérsékleten?

Rövid ideig, például szállítás közben, a száraz por sokkal jobban bírja, mint az oldat, de a tartós tárolás helye a hűtő vagy a fagyasztó, ahogy a COA írja.

Kizárólag kutatási célra. Emberi vagy állati fogyasztásra nem alkalmas.