Når en leverandør skriver, at et peptid har en HPLC-renhed på 99 %, er det et tal, der kræver lidt baggrundsviden at forstå. Hvad måler HPLC egentlig, hvorfor er massespektrometri også nødvendig, og hvad fortæller tallet ikke? Her får du en gennemgang af, hvordan renheden af et peptid måles, så du selv kan vurdere et analysecertifikat (COA).
Kort svar: HPLC (højtydende væskekromatografi) adskiller stofferne i en peptidprøve og måler, hvor stor en del af det samlede signal der kommer fra målpeptidet, angivet som arealprocent. Massespektrometri måler molekylets masse og bekræfter, at det er det rigtige peptid. Først når begge metoder er brugt, har du dokumentation for både renhed og identitet.
HPLC står for high-performance liquid chromatography, på dansk højtydende væskekromatografi. Prøven opløses og pumpes under højt tryk gennem en søjle fyldt med et fint materiale. Stofferne i prøven bevæger sig gennem søjlen med forskellig hastighed og kommer derfor ud på forskellige tidspunkter.
Til peptider bruges næsten altid reversed-phase HPLC. Her er søjlematerialet vandskyende, og peptiderne skylles ud med en blanding af vand og et organisk opløsningsmiddel, hvor andelen af det organiske stof øges gradvist. Trifluoreddikesyre (TFA) er standardtilsætningen i den mobile fase. Jo mere vandskyende et stof er, jo længere tid tager det om at komme ud.
Når stofferne forlader søjlen, passerer de en UV-detektor, typisk ved 214 nm, hvor peptidbindingen absorberer lys, eller ved 220 nm. Resultatet er et kromatogram: en kurve med en top for hvert stof. Arealet under toppen for målpeptidet divideres med det samlede areal af alle toppe. Er toppen for målpeptidet 99 % af det samlede areal, er HPLC-renheden 99 %.
Bølgelængden er vigtig. Urenheder, der ikke absorberer godt ved den valgte bølgelængde, bliver underrepræsenteret i beregningen. Derfor bør et godt certifikat altid angive bølgelængden.
Massespektrometri (MS) måler massen af molekyler. Peptidet omdannes til ioner, typisk med elektrosprayionisering (ESI), og instrumentet måler forholdet mellem masse og ladning. Den observerede masse sammenlignes med den teoretiske masse, som beregnes ud fra sekvensen og molekylformlen.
Et eksempel: Ipamorelin har molekylformlen C38H49N9O5 og en molekylvægt på 711,85 g/mol. Viser massespektret en masse, der passer, er det et stærkt tegn på, at det rigtige molekyle er til stede. Store peptider som TB-500 bærer ofte flere ladninger i ESI og giver derfor flere toppe, som omregnes til én masse. Med tandem-massespektrometri (MS/MS) kan man desuden bekræfte selve sekvensen.
De to metoder svarer på forskellige spørgsmål:
Publiceret karakteriseringsarbejde viser igen og igen, at én metode sjældent kan fastslå både identitet og renhed. Derfor bruger man såkaldte ortogonale metoder, altså metoder, der bygger på forskellige principper. HPLC kombineret med massespektrometri er standarden, og nogle gange suppleres der med NMR eller kapillærelektroforese.
Peptider fremstilles ved at koble aminosyrer på en efter en. Hvert trin kan gå galt, og de typiske urenheder er:
Et eksempel er Semax, hvis sekvens begynder med methionin. Oxideret methionin ændrer både massen og peptidets opførsel på søjlen, så det kan ses som en separat top i kromatogrammet og som en anden masse i massespektret.
Nej. Det er den forskel, der skaber mest forvirring på et certifikat.
Et frysetørret peptid indeholder også vand, salte og modioner, typisk trifluoracetat fra oprensningen. HPLC ser dem ikke. Et peptid kan derfor korrekt angives med 99 % renhed, selv om peptidet udgør en mindre del af vægten. Vandindholdet måles med Karl Fischer-titrering eller vægttab ved tørring, og peptidindholdet med fx kvælstofbestemmelse eller aminosyreanalyse.
Et certifikat med det rå kromatogram og massespektrum er mere værd end en tabel med et enkelt tal, fordi du selv kan vurdere data. Se også, hvordan det hænger sammen med valg af leverandør, i artiklen om peptider i Danmark og i TB-500 Danmark.
Vores peptider oprenses først med præparativ HPLC, indtil kun målmolekylet er tilbage. Derefter bekræfter massespektrometri identiteten, og analytisk HPLC bekræfter renheden. Hvert batch får et analysecertifikat, både internt og fra et uafhængigt laboratorium, og renheden er mindst 99 %. Først derefter frysetørres, fyldes og sendes peptiderne, diskret og med sporing fra EU.
Renhed er kun meningsfuld på et bestemt tidspunkt. Opbevares peptidet forkert, kan det nedbrydes, og så passer tallet ikke længere. Læs derfor også guiden til opbevaring af peptider.
At toppen for målpeptidet udgør 99 % af det samlede integrerede areal i HPLC-kromatogrammet ved den angivne bølgelængde. Det betyder ikke, at 99 % af pulverets vægt er peptid.
Fordi HPLC ikke fortæller, hvilket molekyle toppen er. Massespektrometri bekræfter identiteten ved at måle massen.
Oftest 214 nm, hvor peptidbindingen absorberer, eller 220 nm.
Præparativ HPLC bruges til at oprense peptidet i større mængder. Analytisk HPLC bruges til at måle renheden af det færdige produkt.
En analysemetode, der bygger på et andet princip end den første. HPLC adskiller efter, hvor vandskyende stofferne er, mens massespektrometri måler masse. Sammen giver de et mere pålideligt billede.
Det er ikke nødvendigvis forkert, men uden kromatogram og massespektrum kan du ikke selv vurdere data, og dokumentet bliver en påstand frem for et bevis.
Kun til forskningsbrug. Ikke til indtagelse af mennesker eller dyr.
NAD+ er et coenzym i alle levende celler og et af de mest undersøgte molekyler i cellebiologien. Artiklen forklarer forskellen på NAD+ til forskning og NAD+ som kosttilskud, hvad du skal kræve af dokumentation, og hvordan pulveret håndteres i laboratoriet.
Læs artiklen
Melanotan 2 er et syntetisk, cyklisk peptid, der undersøges som ikke-selektiv agonist for melanocortinreceptorerne. Artiklen forklarer, hvad stoffet er, hvordan det adskiller sig fra PT-141, og hvilken dokumentation du skal kræve til forskning.
Læs artiklen
GHK-Cu er et kobberbindende tripeptid (Gly-His-Lys) med en stor præklinisk litteratur om bindevæv og genudtryk. Artiklen forklarer, hvad kobberpeptidet er, hvad forskningen undersøger, og hvad du skal vide om kvalitet og håndtering.
Læs artiklen