Αποθήκευση πεπτιδίων: ψυγείο, κατάψυξη και σταθερότητα μετά τη διάλυση

Σύντομη απάντηση: Η αποθήκευση πεπτιδίων ακολουθεί έναν απλό κανόνα: η ξηρή, λυοφιλοποιημένη σκόνη είναι πολύ πιο σταθερή από το διάλυμα. Τα σφραγισμένα φιαλίδια φυλάσσονται στο ψυγείο στους 2 έως 8 °C για τρέχουσα χρήση ή στην κατάψυξη στους -20 °C και χαμηλότερα για μεγαλύτερο διάστημα, πάντα μακριά από φως και υγρασία. Μετά τη διάλυση, το διάλυμα μένει στο ψυγείο, μοιράζεται σε μικρές μερίδες και χρησιμοποιείται σε σύντομο διάστημα.

Η φύλαξη είναι η λιγότερο εντυπωσιακή μεταβλητή ενός πειράματος και ένας από τους συχνότερους λόγους που ένα αποτέλεσμα δεν επαναλαμβάνεται. Ένα φιαλίδιο που ταξίδεψε ζεστό, που έμεινε σε καταψύκτη με κύκλους απόψυξης ή που πέρασε μήνες στον πάγκο κάτω από φως δεν είναι πια χημικά ίδιο με αυτό που περιγράφει το πιστοποιητικό ανάλυσης. Ο οδηγός αυτός συνοψίζει τι δείχνει η βιβλιογραφία σταθερότητας και πώς δουλεύουν στην πράξη τα εργαστήρια.

Τι σημαίνει σταθερότητα ενός πεπτιδίου;

Η σταθερότητα δεν είναι μία ιδιότητα αλλά δύο, που μετρώνται χωριστά:

• Χημική σταθερότητα: αν η αλληλουχία των αμινοξέων έχει μείνει ανέπαφη ή αν έχει αλλοιωθεί από υδρόλυση, οξείδωση, απαμίδωση ή ανακατάταξη δισουλφιδικών δεσμών.
• Φυσική σταθερότητα: αν το μόριο βρίσκεται ακόμη στην επιθυμητή κατάσταση ή αν έχει συσσωματωθεί, κολλήσει στα τοιχώματα του φιαλιδίου ή καθιζάνει.

Οι δύο μπορεί να αποκλίνουν. Ένα δείγμα μπορεί να περνά τον έλεγχο ταυτότητας με φασματομετρία μάζας, ενώ σημαντικό μέρος του έχει ήδη συσσωματωθεί και δεν είναι διαθέσιμο στο διάλυμα. Γι' αυτό οι μελέτες σταθερότητας συνδυάζουν συνήθως HPLC για την καθαρότητα με μια μέθοδο που ελέγχει το μέγεθος των μορίων.

Ποιοι παράγοντες καταστρέφουν τα πεπτίδια;

Η βιβλιογραφία σταθερότητας καταλήγει ξανά και ξανά στους ίδιους παράγοντες:

• Θερμοκρασία: οι ρυθμοί αποδόμησης αυξάνονται απότομα με τη ζέστη. Σε αυτό βασίζονται και οι επιταχυνόμενες δοκιμές σταθερότητας.
• Νερό: η υδρόλυση και η απαμίδωση χρειάζονται νερό. Γι' αυτό η υπολειμματική υγρασία στη σκόνη είναι παράμετρος που ελέγχεται.
• Φως: έχει καταγραφεί φωτοαποδόμηση σε ξηρά σκευάσματα πεπτιδίων και πρωτεϊνών, η οποία περιορίστηκε όταν προστέθηκε αδιαφανής δευτερογενής συσκευασία.
• Αλληλουχία: η μεθειονίνη, η κυστεΐνη και η τρυπτοφάνη οξειδώνονται εύκολα, ενώ τα μοτίβα ασπαραγίνης και γλυκίνης είναι κλασικά σημεία απαμίδωσης. Κάθε πεπτίδιο έχει λοιπόν τα δικά του αδύναμα σημεία.
• pH και ρυθμιστικό διάλυμα: η σταθερότητα ενός διαλυμένου πεπτιδίου εξαρτάται έντονα από το pH.
• Κατάψυξη και απόψυξη: οι επαναλαμβανόμενοι κύκλοι προκαλούν συσσωμάτωση, γιατί ο πάγος δημιουργεί διεπιφάνειες και συμπυκνώνει τις ουσίες στο υγρό που απομένει.

Αποθήκευση πεπτιδίων σε σκόνη: ψυγείο ή κατάψυξη;

Και τα δύο, ανάλογα με το πόσο θα περιμένει το φιαλίδιο. Η αφαίρεση του νερού με τη λυοφιλοποίηση είναι αυτό που δίνει στα πεπτίδια τη μεγάλη διάρκεια ζωής. Δημοσιευμένα προγράμματα σταθερότητας σε λυοφιλοποιημένα σκευάσματα πεπτιδίων και πρωτεϊνών έχουν αναφέρει διατήρηση της ακεραιότητας για 12 έως 24 μήνες στους 2 έως 8 °C, με μικρότερα περιθώρια σε θερμοκρασία δωματίου. Για το δικό σας φιαλίδιο, όμως, η αναφορά είναι η συνθήκη που γράφει το COA της παρτίδας, όχι ένας γενικός αριθμός.

Κατάσταση	Συνήθης πρακτική
Σκόνη, τρέχουσα χρήση	ψυγείο, 2 έως 8 °C, σφραγισμένο, μακριά από φως
Σκόνη, μακροχρόνια φύλαξη	κατάψυξη, -20 °C ή χαμηλότερα
Διάλυμα μετά την ανασύσταση	ψυγείο, σύντομο διάστημα, σε μερίδες
Διάλυμα για μεγαλύτερο διάστημα	μερίδες μίας χρήσης στην κατάψυξη, χωρίς επαναψύξη

Πέντε κανόνες για τη σκόνη

1. Αφήστε το κρύο φιαλίδιο να έρθει σε θερμοκρασία δωματίου πριν το ανοίξετε. Αν ανοίξει κρύο, τραβά υγρό αέρα και η υγρασία συμπυκνώνεται πάνω στη σκόνη.
2. Κρατήστε το πώμα σφραγισμένο μέχρι να χρειαστείτε το υλικό. Είναι το κύριο φράγμα για υγρασία και οξυγόνο.
3. Φυλάξτε τα φιαλίδια στο εξωτερικό τους κουτί ή σε αδιαφανές δοχείο.
4. Προτιμήστε καταψύκτη χωρίς αυτόματη απόψυξη για μακροχρόνια φύλαξη, γιατί οι καταψύκτες no frost ανεβοκατεβάζουν σκόπιμα τη θερμοκρασία.
5. Καταγράψτε σε ποια κατάσταση έφτασε το δέμα και κρατήστε το COA μαζί με το αρχείο της παρτίδας.

Πώς διατηρείται ένα πεπτίδιο μετά τη διάλυση;

Τα διαλύματα είναι αισθητά λιγότερο σταθερά από τη σκόνη και αντιμετωπίζονται ως βραχύβια αποθέματα εργασίας. Γι' αυτό μένουν στο ψυγείο και χρησιμοποιούνται μέσα στο παράθυρο σταθερότητας που αναφέρει η τεκμηρίωση της παρτίδας.

• Μοιράστε το διάλυμα σε μερίδες αντί να ανοίγετε ξανά και ξανά το ίδιο φιαλίδιο. Έτσι αποφεύγετε και την κατάψυξη-απόψυξη και την έκθεση στον αέρα.
• Καταγράψτε τέσσερα στοιχεία: διαλύτη, συγκέντρωση, ημερομηνία ανασύστασης και θερμοκρασία φύλαξης. Χωρίς αυτά, ένα μεταγενέστερο αποτέλεσμα καθαρότητας δεν ερμηνεύεται.
• Επιλέξτε σωστό διαλύτη. Το pH και το συντηρητικό διαφέρουν από διαλύτη σε διαλύτη και επηρεάζουν τη σταθερότητα.

Βακτηριοστατικό νερό ή οξικό οξύ;

Το βακτηριοστατικό νερό είναι αποστειρωμένο νερό με 0,9% βενζυλική αλκοόλη ως συντηρητικό. Το συντηρητικό περιορίζει την ανάπτυξη μικροβίων και επιτρέπει να χρησιμοποιείται ένα ανασυσταμένο διάλυμα για μεγαλύτερο διάστημα από ό,τι με απλό αποστειρωμένο νερό. Το ίδιο το βακτηριοστατικό νερό φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου, 15 έως 25 °C, προστατευμένο από επιμόλυνση.

Ορισμένα πεπτίδια χρειάζονται απλό νερό ή αραιό οξύ, όπως αναφέρει η τεκμηρίωσή τους. Τη σύγκριση θα τη βρείτε στο άρθρο οξικό οξύ ή βακτηριοστατικό νερό και τα βήματα της διάλυσης στο πώς γίνεται η ανασύσταση πεπτιδίων.

Δύο παραδείγματα: BPC-157 και GHK-Cu

Το BPC-157 της PureChems διατίθεται ως λυοφιλοποιημένη σκόνη 10 mg σε γυάλινο φιαλίδιο 10 ml. Η συνθήκη φύλαξης είναι 2 έως 8 °C, μακριά από το φως. Η ίδια ένωση σε κάψουλες φυλάσσεται επίσης στο ψυγείο, προστατευμένη από φως και υγρασία.

Το GHK-Cu, το τριπεπτίδιο χαλκού, διατίθεται ως λυοφιλοποιημένη σκόνη 100 mg ανά φιαλίδιο, με την ίδια συνθήκη φύλαξης: 2 έως 8 °C, μακριά από το φως. Και στα δύο, το COA της παρτίδας αναφέρει την καθαρότητα και τη συνθήκη που ισχύει για τη συγκεκριμένη παραλαβή.

Ό,τι κι αν αγοράσετε, η αξία του πιστοποιητικού χάνεται αν η φύλαξη δεν είναι σωστή. Πώς διαβάζεται ένα COA εξηγούμε στον οδηγό για το πιστοποιητικό ανάλυσης πεπτιδίων.

Ποιους όρους χρειάζεται να ξέρετε για την αποθήκευση πεπτιδίων;

Οι οδηγίες φύλαξης και τα πιστοποιητικά ανάλυσης γράφονται με τους παρακάτω όρους. Σε μία ή δύο προτάσεις:

• Λυοφιλοποίηση: αφαίρεση του νερού με ψύξη σε κενό. Το πεπτίδιο μένει ως ξηρή σκόνη, πολύ πιο ανθεκτική από ένα διάλυμα.
• Υδρόλυση: σπάσιμο ενός χημικού δεσμού με τη συμμετοχή νερού. Στα πεπτίδια μπορεί να κόψει την αλυσίδα των αμινοξέων.
• Απαμίδωση: απώλεια της αμιδικής ομάδας από ένα αμινοξύ, συνήθως από την ασπαραγίνη. Αλλάζει το φορτίο και τη δομή του μορίου.
• Συσσωμάτωση: τα μόρια κολλούν μεταξύ τους και σχηματίζουν συσσωματώματα που δεν είναι πια διαθέσιμα στο διάλυμα.
• Μερίδα (aliquot): μικρή ποσότητα διαλύματος που χωρίζεται από το απόθεμα για μία μόνο χρήση.

Συχνές ερωτήσεις

Πόσο αντέχουν τα λυοφιλοποιημένα πεπτίδια;

Δεν υπάρχει ένας αριθμός για όλα, γιατί εξαρτάται από την αλληλουχία, το σκεύασμα και τη θερμοκρασία. Η συνθήκη και η ημερομηνία επανελέγχου στο COA της παρτίδας είναι η σωστή αναφορά.

Γιατί τα πεπτίδια είναι λιγότερο σταθερά όταν διαλυθούν;

Επειδή το νερό συμμετέχει άμεσα στις κύριες χημικές αντιδράσεις αποδόμησης, όπως η υδρόλυση και η απαμίδωση. Στο διάλυμα τα μόρια μπορούν επίσης να συσσωματωθούν και να κολλήσουν στα τοιχώματα.

Βλάπτει η επαναλαμβανόμενη κατάψυξη και απόψυξη;

Ναι. Είναι τυπική συνθήκη καταπόνησης στις μελέτες σταθερότητας, γιατί ο σχηματισμός πάγου ευνοεί τη συσσωμάτωση. Γι' αυτό τα εργαστήρια μοιράζουν το διάλυμα σε μερίδες.

Χρειάζεται ψυγείο το βακτηριοστατικό νερό;

Όχι πριν ανοιχτεί. Φυλάσσεται σε θερμοκρασία δωματίου, 15 έως 25 °C. Τα διαλύματα πεπτιδίων που φτιάχνετε με αυτό μένουν όμως στο ψυγείο.

Είναι αυτές οι οδηγίες για ανθρώπινη χρήση;

Όχι. Περιγράφουν τη διαχείριση εργαστηριακών αντιδραστηρίων. Τα υλικά της PureChems διατίθενται μόνο για έρευνα in vitro και δεν είναι φάρμακα ούτε συμπληρώματα.

Αποκλειστικά για ερευνητική χρήση. Δεν προορίζεται για ανθρώπινη ή ζωική κατανάλωση.