Peptiidi puhtus ja HPLC: mida tähendab ≥99%

Lühidalt: Peptiidi puhtus HPLC järgi näitab, kui suure osa kromatogrammi piikide kogupindalast annab sihtpeptiid. Märge ≥99% tähendab, et muud peptiidiga seotud ained andsid kokku kõige rohkem ühe protsendi pindalast. See ei tähenda, et 99% viaali massist on peptiid, ja molekuli õigsust kinnitab eraldi massispektromeetria.

Puhtusprotsent on uurimispeptiidi juures esimene number, mida vaadatakse. Samas on see ka kõige rohkem valesti mõistetud number. Selleks et aru saada, mida ≥99% tegelikult ütleb, tasub teada, kuidas HPLC töötab ja mida see meetod näeb ning mida mitte.

Mis on HPLC?

HPLC on lühend ingliskeelsest nimetusest high performance liquid chromatography, eesti keeles kõrgefektiivne vedelikkromatograafia. See on analüüsimeetod, mis eraldab segu koostisosad üksteisest ja mõõdab, kui palju igaüht on.

Põhimõte on lihtne. Lahustatud proov juhitakse kõrge rõhu all läbi kitsa kolonni, mis on täidetud väga peente osakestega. Kolonni läbib pidevalt vedelik, mida nimetatakse liikuvaks faasiks. Iga aine seondub kolonni täidisega erineva tugevusega, nii et ained väljuvad kolonnist eri ajal. Aega, mil aine kolonnist väljub, nimetatakse retentsiooniajaks.

Mis on pöördfaas-HPLC?

Peptiidide puhul kasutatakse peaaegu alati pöördfaas-HPLC-d. Selle kolonni täidis on vett tõrjuv. Liikuva faasi koostist muudetakse analüüsi käigus järk-järgult, nii et peptiidid vabanevad kolonnist oma hüdrofoobsuse järjekorras. Liikuvale faasile lisatakse tavaliselt trifluoroäädikhapet, mis teravdab piike.

Mis on gradient?

Analüüsi alguses on liikuvas faasis rohkem vett ja lõpu poole rohkem orgaanilist lahustit. Sellist järkjärgulist muutust nimetatakse gradiendiks. Vesilembesemad ained vabanevad kolonnist varem, hüdrofoobsemad hiljem. Gradiendi kuju mõjutab, kui hästi lähedased ained üksteisest eralduvad, nii et sama proov võib eri meetodiga anda veidi erineva puhtusnumbri.

Kuidas tekib kromatogramm?

Kolonni järel on UV-detektor, mis mõõdab valguse neeldumist. Peptiidide puhul kasutatakse enamasti lainepikkust 214 nm, kus neelab peptiidside, või 220 nm. Iga aine annab graafikule piigi. Seda graafikut nimetatakse kromatogrammiks.

Peptiidi puhtus HPLC järgi: kuidas protsent arvutatakse?

Tarkvara integreerib iga piigi ehk arvutab selle alla jääva pindala. Puhtus on sihtpeptiidi piigi pindala jagatud kõigi integreeritud piikide kogupindalaga. Kui sihtpeptiidi piik moodustab 99% kogupindalast, on puhtus 99%.

Siit tulevad kaks olulist piirangut.

• Meetod näeb ainult seda, mis valitud lainepikkusel neelab. Lisand, millel sellel lainepikkusel tugevat neeldumist pole, jääb alaesindatuks. Seepärast peab korralik analüüsisertifikaat lainepikkuse ära märkima.
• Meetod ei näe vett, soolasid ega vastasioone. Need ei anna peptiidsete ainetega samasugust piiki. Seega on HPLC puhtus suhteline mõõt peptiidsete ainete hulgas, mitte viaali kogu sisu kirjeldus.

Mida ≥99% puhtus tähendab ja mida mitte?

Märge ≥99% tähendab, et sihtpeptiid andis vähemalt 99% kromatogrammi piikide pindalast ja kõik muud tuvastatud peptiidsed ained kokku kõige rohkem ühe protsendi.

See ei tähenda, et pulbrist 99% oleks peptiid. Lüofiliseeritud peptiidis on alati ka imendunud vett, jääksoolasid ja puhastamisest pärit vastasioone. Peptiidi osakaalu kogu massist nimetatakse peptiidisisalduseks ja seda mõõdetakse teiste meetoditega, näiteks lämmastiku määramise või aminohappeanalüüsiga. Mõlemad numbrid on õiged, kuid vastavad eri küsimustele.

Millised lisandid seda ühte protsenti moodustavad?

Sünteetiliste peptiidide tüüpilised lisandid on struktuurilt sihtmolekulile väga lähedased:

• deletsioonijärjestused, kus üks aminohape jäi sünteesil vahele;
• lühenenud ahelad;
• vormid, millelt kaitserühmad pole täielikult eemaldatud;
• oksüdeerunud metioniini või tsüsteiiniga vormid;
• deamideerunud asparagiini või glutamiiniga vormid.

Just sarnasuse tõttu on puhtus uurimistöös oluline. Lisand, mis erineb sihtpeptiidist ühe aminohappe võrra, võib katses käituda teisiti ja moonutada tulemust nii, et põhjust on hiljem raske leida.

Miks puhtus uurimistöös loeb?

• Korratavus. Kui kahe partii lisandiprofiil erineb, võib sama katse anda eri tulemuse ja põhjust on raske leida.
• Kontsentratsiooni täpsus. Lisandid kaaluvad samuti. Mida rohkem on lisandeid, seda vähem sihtainet on tegelikult lahuses, mille kontsentratsioon arvutati kaalutud massi järgi.
• Tõlgendamine. Kui tulemus on ootamatu, peab saama välistada, et selle põhjustas lisand. Kõrge ja dokumenteeritud puhtus teeb selle lihtsamaks.

Kas puhtus võib aja jooksul muutuda?

Võib. Analüüsisertifikaadi number kehtib analüüsi hetkel. Kui peptiid satub hiljem soojusse, niiskusesse või valguse kätte, võivad tekkida uued lagunemissaadused, näiteks oksüdeerunud või deamideerunud vormid. Neid näeks uus HPLC analüüs uute piikidena. Seepärast on õige hoiustamine puhtuse säilitamise osa, mitte eraldi teema.

Miks HPLC kõrval on vaja massispektromeetriat?

HPLC ütleb, kui puhas on peamine piik, kuid mitte seda, kas see piik on õige molekul. Selleks on massispektromeetria. See mõõdab molekuli massi ja võrdleb seda järjestuse põhjal arvutatud teoreetilise massiga. Kui need klapivad, on identsus kinnitatud.

Avaldatud analüüsitöödes korduv järeldus on, et üks meetod ei tõenda korraga identsust ja puhtust. Usaldusväärse tulemuse annab kahe või enama sõltumatu meetodi kooskõla. Lisaks HPLC-le ja massispektromeetriale kasutatakse uurimistöödes vahel ka kapillaarelektroforeesi ja kvantitatiivset TMR-spektroskoopiat.

Kuidas kromatogrammi ise hinnata?

• Peamine piik peaks olema terav ja sümmeetriline, mitte laiali valgunud ega kahe tipuga.
• Baasjoon peaks olema ühtlane. Kõikuv baasjoon muudab integreerimise ebatäpseks.
• Väikesed piigid peamise piigi lähedal on sageli struktuurilt sarnased lisandid. Nende arv ja suurus näitavad sünteesi ja puhastamise kvaliteeti.
• Integreerimine peaks olema nähtav. Kui kromatogrammi pole lisatud, ei saa seda kontrollida.

Kogu analüüsisertifikaadi lugemist samm-sammult selgitab artikkel COA sertifikaat: kuidas seda lugeda. Puhtus on aga tähendusrikas ainult kindlal ajahetkel. Kui peptiidi hoitakse valesti, võib see laguneda ka pärast analüüsi. Sellest räägib juhend peptiidide hoiustamine.

PureChemsi puhtusnõue

Iga PureChemsi partii puhtust ja identsust kontrollib sõltumatu labor HPLC ja massispektromeetriaga ning puhtus on vähemalt 99%. Iga partii kohta on olemas analüüsisertifikaat. Näiteks BPC-157 on 15 aminohappest koosnev sünteetiline peptiid, GHK-Cu on tripeptiidi ja vase kompleks ning Semax on seitsmest aminohappest koosnev peptiid järjestusega Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro. Kõik kolm tulevad lüofiliseeritud pulbrina suletud klaasviaalis.

Korduma kippuvad küsimused

Mida tähendab peptiidi puhtus ≥99%?

Et HPLC kromatogrammis andis sihtpeptiid vähemalt 99% kõigi piikide pindalast antud lainepikkusel. Ülejäänud kuni üks protsent on muud tuvastatud peptiidsed ained.

Kas 99% puhtus tähendab, et viaalis on 99% peptiidi?

Ei. HPLC ei mõõda vett, soolasid ega vastasioone. Peptiidi osakaalu kogu massist näitab peptiidisisaldus, mis määratakse teiste meetoditega.

Mis on pöördfaas-HPLC?

HPLC vorm, mille kolonni täidis on vett tõrjuv. Peptiidid eralduvad selles oma hüdrofoobsuse järgi ja see on peptiidide puhtuse määramisel kõige levinum meetod.

Mis on retentsiooniaeg?

Aeg, mis kulub ainel proovi süstimisest kuni kolonnist väljumiseni. Samadel tingimustel on see iga aine puhul püsiv ja aitab piike tuvastada.

Kas kõrgem puhtus tähendab alati paremat materjali?

Puhtus on üks kolmest olulisest näitajast. Lisaks sellele peab massispektromeetria kinnitama identsust ja partii number peab sobima viaaliga. Kõrge puhtus vale molekuli kohta ei aita uurijat.

Miks on vaja nii HPLC-d kui ka massispektromeetriat?

HPLC mõõdab puhtust, massispektromeetria kinnitab, et tegu on õige molekuliga. Kumbki üksi ei anna täit pilti.

Ainult teadusuuringuteks. Mitte inimestele ega loomadele tarbimiseks.