De HPLC-zuiverheid van een peptide is het percentage van het totale piekoppervlak in een HPLC-chromatogram dat bij het doelpeptide hoort, gemeten bij een vaste golflengte. HPLC laat zien hoe zuiver een monster is, maar niet welk molecuul de hoofdpiek precies is. Daarom toets je de zuiverheid altijd samen met massaspectrometrie, die de identiteit bevestigt.
HPLC staat voor high-performance liquid chromatography, in het Nederlands hogedrukvloeistofchromatografie. Bij peptiden gaat het bijna altijd om reversed-phase HPLC. Het monster wordt opgelost en onder hoge druk door een dunne kolom gepompt die gevuld is met een waterafstotend materiaal.
Tijdens de meting verandert de samenstelling van de vloeistof geleidelijk van vooral water naar steeds meer organisch oplosmiddel, meestal acetonitril met een kleine hoeveelheid trifluorazijnzuur. Stoffen die minder sterk aan de kolom hechten, komen er eerder uit dan stoffen die sterker hechten. Zo worden het doelpeptide en de onzuiverheden van elkaar gescheiden.
Het moment waarop een stof uit de kolom komt, heet de retentietijd. Onder dezelfde omstandigheden is die voor een bepaald peptide steeds ongeveer gelijk. Een retentietijd alleen bewijst echter niet welk molecuul je ziet: twee verschillende stoffen kunnen vrijwel tegelijk uit de kolom komen. Dat is precies waarom er nog een tweede methode nodig is.
Aan het eind van de kolom zit een UV-detector. Die registreert alles wat langskomt en zet het om in een chromatogram: een lijn met pieken over de tijd. Elke piek staat voor een stof. De berekening is eenvoudig:
zuiverheid = oppervlak van de hoofdpiek ÷ oppervlak van alle pieken samen × 100%
Een peptide met ≥99% HPLC-zuiverheid heeft dus een hoofdpiek die minimaal 99% van het totale piekoppervlak beslaat. Belangrijk is de golflengte waarbij is gemeten. Voor peptiden is dat meestal 214 of 220 nm, waar de peptidebinding licht absorbeert. Een stof die bij die golflengte weinig absorbeert, telt nauwelijks mee.
HPLC vertelt je hoeveel van het materiaal in de hoofdpiek zit, maar niet wat die hoofdpiek is. Een verkeerd peptide kan net zo goed één nette, zuivere piek geven. Daar komt massaspectrometrie bij kijken.
Massaspectrometrie (MS) meet de massa van de moleculen. Bij peptiden gebeurt dat vaak met elektrospray-ionisatie (ESI). Komt de gemeten massa overeen met de theoretische massa van de sequentie, dan weet je dat het juiste molecuul aanwezig is. HPLC en MS vullen elkaar dus aan: de één meet zuiverheid, de ander identiteit. In de literatuur over peptideanalyse is dat een vast principe: één methode stelt zelden zowel identiteit als zuiverheid vast.
Veel van deze varianten hebben een massa die net iets afwijkt van het doelpeptide. Daarom is de combinatie van HPLC en MS zo krachtig: een kleine piek naast de hoofdpiek kun je met MS vaak thuisbrengen.
HPLC meet alleen wat de detector ziet. Water, zouten en tegenionen zoals trifluoracetaat vallen erbuiten. Daarom is HPLC-zuiverheid niet hetzelfde als peptidegehalte, het aandeel van de totale massa dat echt peptide is. Een gevriesdroogd peptide kan 99% zuiver zijn en toch een flink deel water en zout bevatten. Wie het precieze gehalte nodig heeft, kijkt naar aanvullende tests zoals een watergehaltebepaling of aminozuuranalyse. Voor lastige gevallen bestaan er ook andere, aanvullende methoden, zoals capillaire elektroforese of kwantitatieve NMR.
Meer over het verschil tussen zuiverheid en gehalte en over de rest van het certificaat lees je in Wat is een COA?.
Bij PureChems wordt elk peptide na synthese gezuiverd met preparatieve HPLC. Daarna bevestigt massaspectrometrie de identiteit en meet analytische HPLC de zuiverheid. Elke batch is bovendien door een extern lab getest met HPLC en MS, met een zuiverheid van minimaal 99% en een COA per batch.
Ook na ontvangst kan de zuiverheid veranderen als een peptide warm, vochtig of in het licht wordt bewaard. Hoe je dat voorkomt, lees je in Peptiden bewaren. Zoek je een leverancier, dan helpt Hoe herken je een betrouwbare peptide leverancier?.
Dat de piek van het doelpeptide minimaal 99% van het totale piekoppervlak in het chromatogram beslaat, bij de vermelde golflengte.
Omdat de peptidebinding bij die golflengtes goed licht absorbeert. Zo zie je vrijwel alle peptideverwante stoffen in het monster.
Ja. HPLC meet alleen de verhouding tussen pieken. Pas massaspectrometrie bevestigt welk molecuul de hoofdpiek is.
Nee. Zuiverheid gaat over het gemeten peptidemateriaal. Peptidegehalte gaat over de totale massa, inclusief water en zouten.
Preparatieve HPLC wordt gebruikt om een peptide te zuiveren. Analytische HPLC meet daarna hoe zuiver het resultaat is.
Ja, als je toegang hebt tot een lab met HPLC en massaspectrometrie. Vergelijk de uitslag met het COA van dezelfde batch en houd rekening met hoe het peptide sinds ontvangst is bewaard.
Uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden. Niet voor menselijke of dierlijke consumptie.
Een overzicht van zes minder bekende onderzoekspeptiden: B7-33, PE22-28, ARA-290, Peptide-5, Adamax en Compound 7P. Per stof lees je waar ze vandaan komen, welk doelwit in het lab wordt onderzocht en hoeveel literatuur er is.
Lees het artikel
Zeven concrete controlepunten om een betrouwbare peptide leverancier te herkennen, van het COA en de onafhankelijke HPLC-test tot opslaginformatie, verzending en betalen. Met de rode vlaggen waar je direct op afhaakt.
Lees het artikelEen COA (Certificate of Analysis) is het analysecertificaat van één batch. Dit artikel legt uit welke gegevens erop staan, wat HPLC en massaspectrometrie meten, waarom zuiverheid niet hetzelfde is als peptidegehalte en hoe je een COA controleert.
Lees het artikel