COA sertifikat analize peptida: kako čitati HPLC i masenu spektrometriju

Ukratko: Sertifikat analize (COA, od engleskog Certificate of Analysis) je dokument laboratorije koji za jednu seriju materijala navodi koji su testovi urađeni, kakvi su rezultati i sa kojom specifikacijom su upoređeni. Kod peptida prvo proverite tri stvari: da oznaka serije odgovara bočici, koliko iznosi čistoća po HPLC analizi i da li se masa iz masene spektrometrije poklapa sa teorijskom masom molekula.

COA je najkorisniji papir koji dobijate uz istraživački peptid, ali i jedan od najčešće pogrešno pročitanih. Broj „99%“ ne znači uvek isto: zavisi od metode, od toga kako je analiza urađena i od toga šta čini preostali procenat. U ovom vodiču idemo red po red.

Šta je sertifikat analize?

COA je izveštaj za tačno određenu proizvodnu seriju. Zato ima smisla samo ako se oznaka serije na dokumentu poklapa sa oznakom na bočici koju držite u ruci. Opšti „sertifikat“ bez oznake serije, ili sa oznakom koja ne odgovara materijalu, ne dokazuje ništa. To je reklamni papir, a ne analitički dokaz.

Šta sve piše na COA za peptid?

Potpun sertifikat za sintetički peptid obično sadrži:

• Naziv i sekvencu: redosled aminokiselina i eventualne izmene, na primer acetilaciju N-kraja ili amidaciju C-kraja. Izmene menjaju masu, pa moraju biti navedene.
• Oznaku serije i datum proizvodnje: sidro za sve ostalo na stranici.
• Molekulsku formulu i teorijsku masu: izračunatu vrednost sa kojom se poredi rezultat masene spektrometrije.
• Izgled: najčešće beo do skoro beo liofilizovani prah.
• Čistoću i metodu: najčešće HPLC reverzne faze, izražena u procentu površine.
• Potvrdu identiteta: masenom spektrometrijom, sa izmerenom i teorijskom masom.
• Dodatne testove: sadržaj vode, ostatke rastvarača, kontrajon i ponekad sadržaj samog peptida.

Kako čitati sertifikat analize korak po korak?

1. Uporedite oznaku serije na dokumentu i na bočici. Ako se ne poklapaju, dalje čitanje nema smisla.
2. Proverite datum i laboratoriju. Analiza treba da ima datum i da navodi ko ju je uradio.
3. Pronađite formulu i teorijsku masu i uporedite ih sa podacima o proizvodu.
4. Pročitajte čistoću po HPLC analizi i proverite da li je navedena talasna dužina detekcije.
5. Uporedite izmerenu masu iz masene spektrometrije sa teorijskom, uključujući izmene sekvence.
6. Potražite sadržaj vode i peptida, navedene odvojeno od čistoće.
7. Pogledajte da li su priloženi hromatogram i maseni spektar, a ne samo tabela sa brojevima.

Šta meri HPLC?

HPLC (tečna hromatografija visoke efikasnosti) razdvaja sastojke uzorka dok prolaze kroz kolonu. Svaki sastojak izlazi u drugo vreme i daje svoj pik na hromatogramu. Čistoća se računa kao udeo površine pika ciljnog peptida u ukupnoj površini svih pikova.

Važna je i talasna dužina detektora, najčešće 214 nm, gde apsorbuje peptidna veza, ili 220 nm. Nečistoće koje na izabranoj talasnoj dužini slabo apsorbuju svetlost biće u proračunu potcenjene. Zato je sirovi hromatogram vredniji od samog broja: na njemu se vide oblik pikova, osnovna linija i način integracije.

Koje nečistoće se javljaju kod peptida?

• sekvence kojima nedostaje jedna aminokiselina, jer se nije vezala tokom sinteze
• skraćene sekvence
• molekuli sa nepotpuno uklonjenim zaštitnim grupama
• oksidovani ostaci metionina ili cisteina
• deamidovani ostaci asparagina ili glutamina

Šta potvrđuje masena spektrometrija?

Masena spektrometrija meri masu molekula. Ako se izmerena masa poklapa sa teorijskom, to potvrđuje da je u bočici zaista deklarisani peptid. Ona ne govori koliko ima drugih supstanci. Zato se identitet i čistoća ne mogu dokazati jednom metodom: HPLC i masena spektrometrija se dopunjuju, a u ozbiljnim analizama ponekad im se pridružuju i NMR ili kapilarna elektroforeza.

Čistoća nije isto što i sadržaj peptida

Ovo je najčešća zabuna. Hromatografska čistoća govori koliki deo detektovanog materijala srodnog peptidu čini ciljni peptid. Sadržaj peptida govori koliki deo ukupne suve mase u bočici uopšte jeste peptid.

Liofilizovani peptid gotovo nikada nije čist peptid po masi. Prah sadrži i vodu upijenu tokom rukovanja, soli i kontrajone iz prečišćavanja. Trifluorosirćetna kiselina (TFA) koristi se pri prečišćavanju i ostaje vezana za bazne ostatke u gotovom prahu, a ponekad se zamenjuje acetatom. Sadržaj vode se meri titracijom po Karlu Fišeru ili gubitkom mase pri sušenju. Materijal zato može tačno da prijavi visoku hromatografsku čistoću, a da peptid čini manji deo mase od onoga što pokaže vaga. Oba broja su ispravna, samo odgovaraju na različita pitanja.

Primer: šta da uporedite kod tri peptida

Ovo su podaci koje navodimo uz naše proizvode. Masa na sertifikatu treba da se poklapa sa teorijskom masom iz tabele.

Peptid	Molekulska formula	Molekulska masa	Oznaka testa
Ipamorelin 10 mg	C38H49N9O5	711,85 g/mol	IPA-2501-A
GHK-Cu 100 mg	C14H24CuN6O4	340,9 g/mol	GHK-2501-A
BPC-157 10 mg	C62H98N16O22	1419,535 g/mol	BPC-2501-A

Kod GHK-Cu obratite pažnju na bakar u formuli: to je kompleks tripeptida i bakra(II), pa i masa uključuje jon metala. Kod BPC-157, lanca od 15 aminokiselina, masa je znatno veća nego kod kratkih peptida.

Šta COA ne govori?

Sertifikat analize opisuje analitička svojstva serije reagensa. On nije dozvola za stavljanje u promet, nije dokaz bezbednosti i ništa ne govori o primeni na živim bićima. Materijal može da ima besprekoran COA i da i dalje bude isključivo laboratorijski reagens. Čistoća i bezbednost su dva različita pojma.

Kako izgleda kontrola kvaliteta u PureChems-u?

• Čistoća od najmanje 99%, izmerena HPLC analizom.
• Identitet potvrđen masenom spektrometrijom.
• Analize radi nezavisna laboratorija, a COA postoji za svaku seriju.
• Sinteza u kontrolisanoj čistoj sobi, prah u zatvorenoj staklenoj bočici.
• Diskretna otprema sa praćenjem iz EU, plaćanje karticom, preko Google Pay ili kriptovalutama.

Šta još da proverite kod prodavca pre narudžbine, pročitajte u članku Gde kupiti peptide u Srbiji, Bosni i Crnoj Gori. Kako uslovi čuvanja menjaju rezultate analize, objašnjavamo u vodiču kako čuvati liofilizovane peptide. Sve peptide sa dokumentacijom pogledajte u kategoriji Peptidi i bioregulatori.

Česta pitanja

Šta znači 99% čistoće na COA?

Da je pik ciljnog peptida na HPLC hromatogramu činio 99% ukupne površine pikova na navedenoj talasnoj dužini. To ne znači da je 99% mase u bočici peptid, jer voda, soli i kontrajoni tom metodom nisu ni detektovani.

Mogu li da verujem COA bez oznake serije ili bez hromatograma?

COA bez oznake serije ne može da se poveže sa vašom bočicom. Dokument sa samo tabelom, bez hromatograma i masenog spektra, ne dozvoljava nezavisnu proveru. To ne mora da znači da nešto nije u redu, ali takav dokument je tvrdnja, a ne dokaz.

Koja je razlika između HPLC čistoće i sadržaja peptida?

HPLC čistoća je udeo ciljne sekvence u detektovanom materijalu srodnom peptidu. Sadržaj peptida je udeo peptida u ukupnoj suvoj masi. Određuju se različitim metodama, a dobar COA navodi oba podatka.

Da li je COA potvrda da je proizvod odobren?

Nije. COA je analitički dokument za seriju i nema nikakvu regulatornu težinu.

Da li uz svaki peptid iz PureChems-a postoji sertifikat analize?

Da. COA postoji za svaku seriju, sa HPLC analizom i masenom spektrometrijom iz nezavisne laboratorije.

Samo za istraživačke svrhe. Nije za ljudsku ni životinjsku konzumaciju.