Сертифікат аналізу пептиду: як читати COA і HPLC

Коротка відповідь. Сертифікат аналізу пептиду (COA, Certificate of Analysis) це документ про конкретну партію, який показує, що саме у флаконі. Чистота «99% за HPLC» означає, що пік цільового пептиду займає 99% площі всіх піків на хроматограмі, а мас-спектрометрія підтверджує, що це саме та молекула. Документ має сенс лише тоді, коли номер партії в ньому збігається з номером на вашому флаконі.

Для кожного, хто працює з дослідницькими пептидами, COA є найінформативнішим папером у коробці. Водночас це один із документів, які найчастіше читають неправильно. Цифра «99%» важить зовсім по-різному залежно від методу, умов аналізу і того, з чого складається решта 1%. Розбираємо по порядку.

Що таке сертифікат аналізу пептиду?

Сертифікат аналізу пептиду це підсумковий звіт про конкретну виробничу партію. У ньому записано, які тести провели, які результати отримали і з якою специфікацією їх порівнювали. Оскільки документ прив'язаний до партії, він корисний лише тоді, коли номер партії (lot) на документі збігається з номером на флаконі.

«Загальний» COA без номера партії або з номером, що не відповідає вашому матеріалу, не дає жодної простежуваності. Такий документ варто сприймати як рекламу, а не як аналітичний доказ.

Які дані має містити COA?

• Назва і послідовність. Для пептидів це послідовність амінокислот в одно- або трилітерному коді і всі модифікації, наприклад ацетилування N-кінця чи амідування C-кінця.
• Номер партії і дата виробництва. Опора для всіх інших даних.
• Молекулярна формула і теоретична маса. З нею порівнюють результат мас-спектрометрії.
• Зовнішній вигляд. Зазвичай білий або майже білий ліофілізований порошок.
• Чистота і метод. Найчастіше обернено-фазова високоефективна рідинна хроматографія (HPLC), результат у відсотках площі.
• Підтвердження ідентичності. Зазвичай мас-спектрометрія: виміряна маса проти теоретичної.
• Додаткові тести. Вміст води, залишкових розчинників, протиіонів, інколи вміст пептиду.

Що означає «чистота 99%» за HPLC?

На хроматограмі кожна речовина дає свій пік. Чистота за HPLC це частка площі піку цільового пептиду від загальної площі всіх піків, виміряних за певної довжини хвилі. Найчастіше це 214 нм, на якій поглинає пептидний зв'язок, або 220 нм.

Довжина хвилі має значення: домішки, які слабо поглинають на обраній хвилі, на хроматограмі будуть недооцінені. Тому добрий COA завжди вказує, за якої довжини хвилі визначено чистоту.

Що показує мас-спектрометрія?

Мас-спектрометрія встановлює ідентичність: порівнює виміряну масу з теоретичною. Вона підтверджує, що потрібна молекула у флаконі є, але сама по собі не каже, скільки там іншого. Тому HPLC і мас-спектрометрія доповнюють одне одного.

Чим чистота відрізняється від вмісту пептиду?

Це найчастіша плутанина. Хроматографічна чистота показує, яка частка виявленого пептидного матеріалу є цільовим пептидом. Вміст пептиду показує, яка частка всієї сухої маси у флаконі взагалі є пептидом.

Ліофілізований синтетичний пептид рідко складається лише з пептиду. У порошку є вода, поглинена під час роботи, залишкові солі і протиіони після очищення. Стандартна добавка для препаративного очищення, трифтороцтова кислота, залишається зв'язаною з основними залишками амінокислот. Залежно від послідовності вода, сіль і протиіони можуть становити помітну частку маси.

Отже, препарат може чесно мати 98% хроматографічної чистоти, а пептид становитиме значно меншу частку того, що показують ваги. Обидві цифри правильні, просто відповідають на різні питання.

Які домішки трапляються в пептидах?

• делеційні послідовності, коли одна амінокислота не приєдналася під час синтезу;
• вкорочені послідовності;
• частково не зняті захисні групи;
• окиснені залишки метіоніну або цистеїну;
• дезамідовані залишки аспарагіну або глутаміну.

Окремо від чистоти вказують протиіон (зазвичай трифторацетат, інколи ацетат) і вміст води, який визначають титруванням за Карлом Фішером або втратою маси при висушуванні.

Чому одного методу недостатньо?

Опубліковані роботи з характеризації пептидів раз у раз показують: жоден окремий метод не встановлює водночас і ідентичність, і чистоту. Надійну картину дають ортогональні методи, тобто такі, що працюють на різних принципах. Зазвичай це HPLC разом із мас-спектрометрією, інколи також капілярний електрофорез або ЯМР. Одна цифра у відсотках на COA стискає складну аналітичну картину до одного числа, тому сирі дані цінніші за підсумкову таблицю.

Як перевірити COA: шість питань

1. Чи збігається номер партії в документі з номером на флаконі?
2. Чи є дата аналізу і назва лабораторії, яка його виконала?
3. Чи додано саму хроматограму і мас-спектр, а не лише підсумкову таблицю? Сирі дані дають змогу оцінити форму піків, базову лінію та інтегрування.
4. Чи вказано довжину хвилі для чистоти за HPLC?
5. Чи наведено вміст пептиду і води окремо від хроматографічної чистоти?
6. Чи відповідає виміряна маса теоретичній для заявленої послідовності з усіма модифікаціями?

Відсутність одного з пунктів ще не доводить проблему, але перетворює документ із перевірюваного доказу на звичайне твердження.

Чого COA не означає?

Сертифікат аналізу описує аналітичні властивості партії реагенту. Це не дозвіл на продаж лікарського засобу, не доказ безпеки і жодним чином не свідчення придатності для введення живому організму. Чистота і безпечність це різні поняття, і їх змішування є найпоширенішою помилкою під час читання таких документів. COA також не змінює регуляторного статусу речовини.

Як COA пов'язаний зі зберіганням?

Ліофілізований порошок гігроскопічний, тому вміст води змінюється залежно від того, як матеріал зберігали. Тримайте COA разом із записом про партію, датою отримання і датою розведення. Без цього через кілька місяців неможливо пояснити дивний результат. Про правила зберігання читайте в гіді Як зберігати пептиди.

Як це виглядає в PureChems

Кожен продукт PureChems має чистоту від 99%, яку незалежна лабораторія підтверджує двома методами, HPLC і мас-спектрометрією, а до кожної партії є сертифікат аналізу. Відправляємо з країни ЄС у непомітній упаковці, з номером для відстеження. Оплатити можна карткою, через Google Pay або криптовалютою. Як обрати постачальника, пояснюємо в статті Де купити дослідницькі пептиди.

Часті запитання

Що означає 99% чистоти в сертифікаті аналізу пептиду?

Зазвичай це означає, що на хроматограмі HPLC пік цільового пептиду займає 99% загальної площі піків за вказаної довжини хвилі. Це не означає, що 99% маси у флаконі є пептидом, бо воду, солі і протиіони цей метод не виявляє.

Чим чистота за HPLC відрізняється від вмісту пептиду?

Чистота показує частку цільової послідовності серед виявленого пептидного матеріалу, вміст пептиду показує частку пептиду в усій сухій масі. Їх визначають різними методами.

Навіщо потрібна мас-спектрометрія, якщо є HPLC?

HPLC показує, наскільки чистий матеріал, а мас-спектрометрія підтверджує, що це саме та молекула. Разом вони дають надійну картину.

Чи можна довіряти COA без номера партії?

Такий документ не можна пов'язати з вашим флаконом, тож він не дає простежуваності. Це твердження, а не доказ.

Чи означає COA, що пептид схвалений?

Ні. Сертифікат аналізу є аналітичним документом партії і не має регуляторної сили. Дослідницькі пептиди не схвалені для людей або тварин.

Лише для наукових досліджень. Не для споживання людиною чи твариною.