Skladování peptidů v laboratoři: teplota, světlo a stabilita

Při skladování peptidů platí jednoduché pravidlo: suchý lyofilizovaný prášek je mnohem stabilnější než roztok. Prášek se běžně uchovává v lednici při 2 až 8 °C, pro delší dobu zmrazený při −20 °C nebo níž, vždy v suchu a chráněný před světlem. Rozpuštěný peptid je krátkodobá pracovní zásoba, která patří do lednice a dělí se do alikvotů, aby se nemusel opakovaně rozmrazovat.

Skladování je nejméně zajímavá proměnná celého pokusu, a přitom jeden z nejčastějších důvodů, proč se výsledky nedaří zopakovat. Lahvička, která prošla teplou přepravou, mrazákem s automatickým odmrazováním nebo půl roku ležela na stole pod zářivkou, už chemicky neodpovídá tomu, co popisuje její certifikát analýzy.

Co znamená stabilita peptidu?

Stabilita není jedna vlastnost, ale dvě otázky, které se měří odděleně:

• Chemická stabilita: zůstala kovalentní struktura neporušená? Sekvenci může změnit hydrolýza, oxidace, deamidace nebo přeskupení disulfidických můstků.
• Fyzikální stabilita: existuje molekula stále v zamýšleném stavu? Sem patří shlukování (agregace), přilnutí ke stěnám nádoby, vysrážení a zhroucení lyofilizovaného koláče.

Obě se mohou rozcházet. Vzorek může projít kontrolou identity hmotnostní spektrometrií, a přitom velká část peptidu už bude agregovaná a v roztoku nedostupná.

Skladování peptidů: co rozhoduje o stabilitě?

Literatura o formulaci peptidů a bílkovin opakovaně jmenuje stejné faktory:

• Teplota: rychlost rozkladu s teplem prudce roste. Na tom stojí i zrychlené testy stability.
• Voda: hydrolýza a deamidace vodu potřebují, proto se u lyofilizátu sleduje zbytková vlhkost.
• Světlo: fotodegradace suchých peptidových přípravků je popsaná a sekundární neprůhledný obal ji podle publikovaných prací potlačuje.
• Složení sekvence: methionin, cystein a tryptofan snadno oxidují, motiv asparagin-glycin je klasickým místem deamidace. Náchylnost se proto liší peptid od peptidu.
• pH a pufr: stabilita rozpuštěného peptidu silně závisí na pH.
• Zmrazování a rozmrazování: při tvorbě ledu vznikají rozhraní, která podporují agregaci.

Jak skladovat lyofilizovaný peptid?

1. Nechte zavřenou lahvičku ohřát na pokojovou teplotu, než ji otevřete. Studená lahvička nasaje vlhký vzduch a zkondenzovaná voda je přesně to, co má suché skladování vyloučit.
2. Krátkodobě v lednici, dlouhodobě v mrazáku. Pro běžné uchování se používá 2 až 8 °C, pro delší dobu −20 °C nebo níž. Referencí jsou vždy podmínky uvedené v dokumentaci k šarži.
3. Chraňte před světlem. Lahvičky nechte v krabičce nebo v neprůhledné nádobě.
4. Neporušujte uzávěr dřív, než je potřeba. Neprorazená zátka je hlavní bariérou proti vlhkosti a kyslíku.

Lednice, nebo mrazák?

Pro peptidy, se kterými budete pracovat v dohledné době, stačí lednice. Pokud plánujete delší uchování, je mrazák bezpečnější volbou. Pozor ale na mrazáky s automatickým odmrazováním (no frost): záměrně cyklují teplotu, a pro dlouhodobé skladování proto nejsou rovnocenné mrazákům s ručním odmrazováním.

Jak skladovat rozpuštěný peptid?

• Roztok je krátkodobá zásoba. Je výrazně méně stabilní než prášek, a proto patří do lednice a spotřebovává se v době, kterou udává dokumentace.
• Dělte na alikvoty. Místo opakovaného otevírání jedné lahvičky rozdělte roztok do menších dávek na jedno použití. Omezíte tím cykly zmrazení a rozmrazení i opakovaný kontakt se vzduchem.
• Zapisujte čtyři údaje: rozpouštědlo, koncentraci, datum rekonstituce a teplotu skladování. Bez nich nelze pozdější výsledek čistoty interpretovat.
• Zvolte vhodné rozpouštědlo. pH i konzervační látka ovlivňují stabilitu. Rozdíly vysvětluje článek Kyselina octová 0,6 % nebo bakteriostatická voda, samotné bakteriostatické vodě se věnuje článek Bakteriostatická voda při rekonstituci peptidů.

Skladovací podmínky u vybraných peptidů

Konkrétní podmínky vždy najdete v dokumentaci k šarži. Pro představu uvádíme, co platí u tří našich lyofilizovaných peptidů:

Semax je dobrý příklad, proč záleží na sekvenci: jeho řetězec Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro obsahuje methionin, jednu z aminokyselin, které nejsnáze oxidují. U takových peptidů má smysl ještě důsledněji omezit kontakt se vzduchem a světlem.

Kapsle a hotové roztoky mají vlastní pravidla

Ne každá výzkumná látka je lyofilizovaný peptid. Kapsle, například SLU-PP-332, se podle dokumentace uchovávají při pokojové teplotě 15 až 25 °C, chráněné před vlhkostí a světlem. Hotové roztoky, jako je ATP nebo L-karnitin, patří do lednice při 2 až 8 °C a mimo světlo. Neotevřená bakteriostatická voda a kyselina octová 0,6 % se skladují při pokojové teplotě a chrání se před kontaminací. Univerzální pravidlo „všechno do mrazáku“ tedy neplatí. Vždy rozhoduje forma látky a pokyn v dokumentaci k šarži.

Dokumentace: nejlevnější pojistka

• Zapište datum příjmu a stav, v jakém zásilka dorazila.
• Certifikát analýzy založte k záznamu o šarži, aby byla čistota vždy čitelná vedle historie skladování. Jak COA číst, vysvětluje článek Certifikát analýzy (COA) u peptidů.
• Poznamenejte si výpadky mrazáku a každé delší otevření.

Naše peptidy dodáváme jako lyofilizovaný prášek v uzavřených skleněných lahvičkách se sterilním uzávěrem, s čistotou ≥99 % ověřenou nezávislou laboratoří metodou HPLC a hmotnostní spektrometrií. Certifikát analýzy je k dispozici ke každé šarži. Zásilky posíláme diskrétně a se sledováním v rámci EU.

Časté otázky o skladování peptidů

Jak dlouho vydrží lyofilizovaný peptid?

Jedno číslo neexistuje, záleží na sekvenci, formulaci a podmínkách. Publikované studie stability lyofilizovaných přípravků uvádějí zachovanou celistvost v řádu jednoho až dvou let v lednici, při pokojové teplotě kratší dobu. Pro konkrétní šarži platí podmínky v její dokumentaci.

Proč je peptid po rozpuštění méně stabilní?

Protože se voda přímo účastní hlavních rozkladných reakcí, hydrolýzy a deamidace. Rozpuštěné molekuly se navíc mohou shlukovat a přilínat ke stěnám nádoby.

Škodí peptidům opakované zmrazování a rozmrazování?

Ano. Tvorba ledu vytváří rozhraní, která podporují agregaci, a koncentruje rozpuštěné látky ve zbývající kapalině. Proto se roztoky dělí na alikvoty.

Musí se peptid po doručení hned dát do lednice?

Lyofilizovaný prášek je odolnější než roztok, ale po doručení ho uložte podle podmínek v dokumentaci k šarži, u většiny našich peptidů do lednice při 2 až 8 °C.

Musí být peptid chráněný před světlem i v lednici?

Ano. Světlo může suchý peptid poškodit i při nízké teplotě, proto lahvičky nechávejte v krabičce nebo v neprůhledné nádobě i uvnitř lednice či mrazáku.

Jak poznám, že se peptid rozložil?

Varovným signálem je změna vzhledu: prášek, který má být sypký bílý koláč, ztmavne, slepí se nebo zvlhne, případně roztok zůstane zakalený. Jistotu ale dá jen analýza, typicky HPLC. Pokud máte pochybnosti, porovnejte stav s údaji v certifikátu analýzy a s historií skladování v záznamech.

Proč nechat lahvičku před otevřením ohřát?

Aby na studený prášek nezkondenzovala vzdušná vlhkost. Ta by zvýšila obsah vody a urychlila rozklad.

Pouze pro výzkumné účely. Není určeno k lidské ani zvířecí spotřebě.