Sådan læser du et analysecertifikat (COA) for peptider

Et analysecertifikat (COA, Certificate of Analysis) for et peptid er en rapport for ét bestemt batch, som viser, hvilke test laboratoriet har lavet, og hvad resultatet blev. De to vigtigste tal er renheden målt med HPLC og identiteten bekræftet med massespektrometri. Et COA er kun noget værd, når batchnummeret på dokumentet passer med batchnummeret på hætteglasset.

Certifikatet er det mest oplysende stykke papir, der følger med et forskningspeptid, og samtidig et af de mest misforståede. "99 % renhed" vejer meget forskelligt alt efter metoden bag tallet, og alt efter hvad den sidste procent består af. Her gennemgår vi felterne et for et, forklarer metoderne og giver dig en tjekliste, du kan bruge på ethvert COA.

Hvad er et analysecertifikat for peptider?

Et COA er en sammenfattende rapport, der udstedes for et bestemt produktionsbatch. Den registrerer de test, der er udført, de resultater, der kom ud af dem, og den specifikation, hvert resultat er holdt op imod. Fordi rapporten hører til ét batch, giver den kun mening sammen med det materiale, den beskriver. Et generelt certifikat uden batchnummer, eller med et nummer der ikke svarer til hætteglasset, kan ikke spores og er reelt reklame snarere end analytisk dokumentation.

Hvilke oplysninger står der på et COA?

Et grundigt analysecertifikat for et syntetisk peptid indeholder typisk disse felter:

• Navn og sekvens. Rækkefølgen af aminosyrer med en- eller trebogstavskoder og eventuelle modifikationer, fx acetylering i N-terminalen eller amidering i C-terminalen. Modifikationer ændrer både massen og opførslen i kolonnen, så de hører med.
• Batchnummer og fremstillingsdato. Ankeret for sporbarheden af alt andet på siden.
• Molekylformel og teoretisk molekylvægt. Den beregnede masse, som resultatet fra massespektrometrien sammenlignes med.
• Udseende. Som regel et hvidt til råhvidt lyofiliseret pulver.
• Renhed og metode. Oftest HPLC med omvendt fase (reversed phase), angivet som arealprocent.
• Identitet. Normalt massespektrometri, hvor den målte masse står over for den teoretiske.
• Supplerende test. Vandindhold, restopløsningsmidler, indhold af modion og nogle gange peptidindhold.

Hvad betyder 99 % renhed målt med HPLC?

HPLC (højtryksvæskekromatografi) adskiller stofferne i en prøve, så de kommer ud af kolonnen på forskellige tidspunkter. En detektor registrerer hvert stof som en top i et kromatogram. Renheden angives som den andel af det samlede areal under toppene, som målpeptidet står for. 99 % betyder altså, at målpeptidets top udgør 99 % af det areal, detektoren så.

Detektionsbølgelængden er vigtig. Den står som regel på 214 nm, hvor peptidbindingen absorberer, eller 220 nm. Urenheder, der ikke absorberer godt ved den valgte bølgelængde, bliver underrepræsenteret. Derfor bør bølgelængden altid stå på certifikatet.

Typiske urenheder i et syntetisk peptid

• Deletionssekvenser, hvor en aminosyre ikke blev koblet på
• Afkortede sekvenser
• Rester, der ikke er fuldt afbeskyttet
• Oxideret methionin eller cystein
• Deamiderede asparagin- eller glutaminrester

Er renhed det samme som peptidindhold?

Nej, og det er den forveksling, der skaber mest forvirring. Renhed fortæller, hvor stor en del af det peptidrelaterede materiale der er det rigtige peptid. Peptidindhold fortæller, hvor stor en del af pulverets samlede vægt der overhovedet er peptid.

Et frysetørret peptid er sjældent rent peptid målt på vægt. Pulveret indeholder også vand, der er optaget under håndteringen, salte og modioner fra oprensningen. Trifluoreddikesyre (TFA) bruges som standard i den præparative oprensning og bliver siddende på basiske aminosyrer i det færdige pulver. Et peptid kan derfor have en helt korrekt HPLC-renhed på 99 %, mens selve peptidet udgør en mærkbart mindre del af det, vægten viser. Begge tal er rigtige. De svarer bare på forskellige spørgsmål.

Hvad bekræfter massespektrometri?

Massespektrometri (MS) vejer molekylet. Laboratoriet sammenligner den målte masse med den teoretiske masse for sekvensen, inklusive modifikationer. Passer de, er identiteten bekræftet. MS fortæller dog ikke, hvor meget andet der er i prøven. Derfor bruges HPLC og MS sammen: den ene metode viser, at det er det rigtige stof, den anden viser, hvor rent det er. Ingen af dem kan stå alene.

Vil du dykke længere ned i selve metoderne, så læs HPLC og massespektrometri: sådan måles renheden af et peptid.

Tjekliste: 6 spørgsmål til ethvert COA

1. Passer batchnummeret på dokumentet med batchnummeret på hætteglasset?
2. Er analysen dateret, og er det angivet, hvilket laboratorium der har udført den?
3. Er selve kromatogrammet og massespektret vedlagt, eller kun en tabel med resultater?
4. Står detektionsbølgelængden ved HPLC-renheden?
5. Er peptidindhold og vandindhold angivet adskilt fra renheden?
6. Passer den målte masse med den teoretiske masse for sekvensen, inklusive modifikationer?

Rå kromatogrammer og spektre er mere værd end en oversigtstabel, fordi du selv kan vurdere toppenes form, basislinjen og integrationen. Et certifikat uden disse data er ikke nødvendigvis et tegn på problemer, men det reducerer dokumentet til en påstand.

Hvad et analysecertifikat ikke fortæller

Et COA dokumenterer de analytiske egenskaber ved et batch reagens. Det er ikke en godkendelse fra myndighederne, det er ikke bevis for sikkerhed, og det siger intet om, hvorvidt stoffet egner sig til levende organismer. Forskningspeptider i EU er kemiske reagenser og ikke lægemidler. Et materiale kan have et helt korrekt certifikat med høj renhed og rigtig masse og stadig udelukkende være et laboratoriereagens. Renhed og sikkerhed er to forskellige ting.

Sådan dokumenterer PureChems hvert batch

Hos PureChems bliver hvert batch analyseret, før det sendes. Identiteten bekræftes med massespektrometri, og renheden måles med HPLC til mindst 99 %. Analyserne udføres af et uafhængigt tredjepartslaboratorium, og der findes et analysecertifikat til hvert batch. På produktsiden står desuden et testnummer, som knytter produktet til dokumentationen.

Tre eksempler fra sortimentet:

• BPC-157 10 mg: et pentadecapeptid på 15 aminosyrer, lyofiliseret pulver
• GHK-Cu 100 mg: et kobberpeptid, kompleks af glycyl-histidyl-lysin og kobber(II)
• Retatrutide 10 mg: en sekvensdefineret peptidanalog, lyofiliseret pulver

Hvordan arkiverer du et COA i laboratoriet?

Gem certifikatet sammen med batchnummeret, datoen for modtagelse og datoen for rekonstituering. Det er det, der gør et resultat sporbart flere måneder senere. Uden den kobling kan et afvigende forsøgsresultat ikke med sikkerhed føres tilbage til materialet. Pulver og opløsninger har forskellig stabilitet, så skriv også ned, hvornår og hvordan pulveret blev opløst. Mere om det i Opbevaring af peptider: temperatur, lys og holdbarhed.

Ofte stillede spørgsmål om analysecertifikater

Hvad betyder 99 % renhed på et COA?

At målpeptidets top udgør 99 % af det samlede topareal i HPLC-kromatogrammet ved den angivne bølgelængde. Det betyder ikke, at 99 % af pulverets vægt er peptid, fordi vand, salte og modioner ikke ses med den metode.

Hvad er forskellen på HPLC-renhed og peptidindhold?

HPLC-renhed er andelen af det peptidrelaterede materiale, der er den rigtige sekvens. Peptidindhold er andelen af pulverets tørvægt, der er peptid. Et grundigt COA angiver begge dele.

Kan jeg stole på et COA uden batchnummer?

Et certifikat uden batchnummer kan ikke kobles til det hætteglas, du står med, og giver derfor ingen sporbarhed.

Er et analysecertifikat en godkendelse af peptidet?

Nej. Et COA er et analytisk dokument for ét batch. Det har ingen status som godkendelse og siger intet om sikkerhed.

Får jeg et COA, når jeg bestiller hos PureChems?

Ja. Der findes et analysecertifikat til hvert batch, baseret på HPLC og massespektrometri fra et uafhængigt laboratorium.

Kun til forskningsbrug. Ikke til indtagelse af mennesker eller dyr.