Peptidien säilytys laboratoriossa: lyofilisoitu jauhe ja liuos

Peptidien säilytys on yksinkertaista, kun muistaa pääsäännön: kylmäkuivattu eli lyofilisoitu peptidi säilyy parhaiten suljetussa pullossa kylmässä, kuivassa ja pimeässä, lyhyemmin 2–8 °C:ssa ja pidempään –20 °C:ssa tai kylmemmässä. Liuotettu peptidi on paljon herkempi, joten se pidetään jääkaapissa, jaetaan kertakäyttöisiin eriin ja käytetään lyhyen ajan sisällä. Tärkein yksittäinen ohje on erän analyysitodistukseen merkitty säilytysolosuhde.

Säilytys on peptidikokeen huomaamattomin muuttuja ja samalla yksi yleisimmistä syistä siihen, ettei tulos toistu. Pullo, joka on ollut lämpimässä kuljetuksessa, sulatusjaksoja tekevässä pakastimessa tai puoli vuotta pöydällä loisteputken alla, ei ole kemiallisesti sama kuin analyysitodistuksessa kuvattu pullo. Tämä opas kokoaa, mitä julkaistu stabiiliuskirjallisuus kertoo peptidien säilymisestä jauheena ja liuoksena.

Mitä peptidin stabiilius tarkoittaa?

Stabiilius jakautuu kahteen kysymykseen, jotka mitataan erikseen.

• Kemiallinen stabiilius kertoo, onko molekyylin kovalenttinen rakenne ehjä. Aminohappoketju voi muuttua hydrolyysin, hapettumisen, deamidaation tai disulfidisidosten uudelleenjärjestymisen kautta.
• Fysikaalinen stabiilius kertoo, onko molekyyli edelleen halutussa tilassa. Ongelmia ovat aggregaatio eli kasautuminen, tarttuminen astian seinämiin, saostuminen ja kylmäkuivatun kakun romahtaminen.

Nämä voivat erota toisistaan. Näyte voi läpäistä massaspektrometrisen tunnistuksen, vaikka merkittävä osa siitä on kasautunut eikä ole enää liuoksessa. Siksi stabiiliustutkimuksissa käytetään tavallisesti sekä käänteisfaasi-HPLC:tä puhtauden mittaamiseen että kokoon perustuvaa menetelmää, kuten kokoekskluusio-HPLC:tä tai geelielektroforeesia.

Miksi kylmäkuivattu jauhe säilyy paremmin kuin liuos?

Koska vesi osallistuu suoraan tärkeimpiin hajoamisreaktioihin. Peptidirungon hydrolyysi ja asparagiinin ja glutamiinin deamidaatio vaativat vettä. Liuenneet molekyylit pääsevät myös kasautumaan ja tarttumaan astian pintoihin. Kun vesi poistetaan kylmäkuivaamalla, säilyvyys pitenee selvästi.

Peptidien ja proteiinien stabiiliutta on tutkittu enimmäkseen lääkevalmisteiden formulaatiotutkimuksena eikä yksittäisten tutkimusyhdisteiden kohdalla. Toistuva havainto on, että kuiva kylmäkuivattu tila on paljon anteeksiantavampi kuin liuos. Julkaistuissa kylmäkuivattujen peptidi- ja proteiinivalmisteiden stabiiliusohjelmissa rakenteen on raportoitu säilyneen 12–24 kuukautta 2–8 °C:ssa, ja huoneenlämmössä aika on ollut lyhyempi. Yleistä lukua tärkeämpi on kuitenkin oman erän analyysitodistukseen merkitty säilytysolosuhde.

Mitkä tekijät heikentävät peptidin säilyvyyttä?

• Lämpötila. Hajoamisreaktiot nopeutuvat jyrkästi lämmön myötä. Tähän perustuu myös kiihdytetty stabiiliustestaus.
• Vesi. Kylmäkuivatun kakun jäännöskosteus on rutiininomaisesti seurattava laatuparametri.
• Valo. Kuivien peptidivalmisteiden valohajoamista on raportoitu, ja läpinäkymätön ulkopakkaus on estänyt sitä.
• Aminohappojärjestys. Metioniini, kysteiini ja tryptofaani hapettuvat herkästi, ja asparagiini-glysiini-jaksot ovat tyypillisiä deamidaatiokohtia. Herkkyys riippuu siis sekvenssistä.
• pH ja puskuri. Liuenneen peptidin stabiilius riippuu voimakkaasti pH:sta, ja puskurin laatu voi muuttaa hajoamisnopeutta samassakin pH:ssa.
• Apuaineet. Sokereita, kuten trehaloosia, sakkaroosia ja mannitolia, tutkitaan kylmäkuivauksen suoja-aineina.
• Jäädytys ja sulatus. Jään muodostuminen luo rajapintoja, jotka edistävät kasautumista. Siksi toistuva jäädytys ja sulatus on vakiintunut rasitustesti.

Mitkä peptidit ovat erityisen herkkiä?

Kaikki peptidit eivät ole yhtä herkkiä, ja aminohappojärjestyksestä voi päätellä paljon jo etukäteen.

• Hapettuvat aminohapot. Jos sekvenssissä on metioniinia, kysteiiniä tai tryptofaania, peptidi kannattaa suojata erityisen huolellisesti hapelta ja valolta.
• Disulfidisillat. Peptidit, joiden rakenne nojaa disulfidisidoksiin, voivat menettää laskostuneen muotonsa pelkistävissä olosuhteissa.
• Metallikompleksit. Kuparipeptidit, kuten GHK-Cu, voivat olla herkkiä pH:lle ja hapettumiselle. Niistä kerrotaan artikkelissa GHK-Cu eli kuparipeptidi.
• Muokatut peptidit. D-aminohapoista rakennetut tai muuten muokatut peptidit kestävät entsyymejä paremmin, mutta voivat käyttäytyä liuoksessa eri tavalla kuin tavalliset peptidit.

Miten kylmäkuivattu peptidi säilytetään?

• Anna suljetun pullon lämmetä huoneenlämpöön ennen avaamista. Kylmään pulloon tiivistyy kosteutta juuri siihen jauheeseen, jonka kuivana pitäminen on säilytyksen koko idea. Kylmäkuivatut peptidit ovat lisäksi hygroskooppisia eli ne imevät kosteutta ilmasta.
• Säilytä 2–8 °C:ssa lyhyempiä aikoja tai –20 °C:ssa ja kylmemmässä, kun säilytys on pidempi. Vertailukohtana on analyysitodistukseen merkitty olosuhde.
• Suojaa valolta. Pidä pullot alkuperäisessä ulkopakkauksessa tai läpinäkymättömässä rasiassa.
• Pidä sinetti ehjänä, kunnes materiaalia tarvitaan. Ehjä kumitulppa ja puristuskorkki ovat ensisijainen este kosteudelle ja hapelle.

Lyhyet jaksot 2–8 °C:ssa kuljetuksen aikana kylmäkuivattu materiaali kestää yleensä hyvin. Kirjaa silti vastaanotettaessa, missä kunnossa paketti saapui.

Mitä tarkistaa, kun paketti saapuu?

Säilytys alkaa jo vastaanotosta. Tarkista ainakin nämä:

• Pullon sinetti ja korkki ovat ehjät.
• Pullon eränumero vastaa analyysitodistuksen eränumeroa.
• Jauhe on ulkonäöltään valkoista tai lähes valkoista ja irtonaista. Värimuutos tai paakkuuntuminen jauheessa, jonka pitäisi olla tasainen kakku, on syy selvittää asia ennen kokeita.
• Pullot siirretään heti ohjeen mukaiseen lämpötilaan.

Miten liuotettu peptidi säilytetään?

• Liuokset ovat selvästi jauhetta epävakaampia, ja niitä käsitellään lyhytikäisinä työliuoksina jääkaapissa. Useimpien peptidien liuosstabiilius jääkaappilämmössä mitataan viikoissa eikä kuukausissa.
• Jaa liuos kertakäyttöisiin eriin sen sijaan, että avaisit samaa pulloa toistuvasti. Tämä vähentää sekä jäädytys- ja sulatuskiertoja että ilmalle altistumista.
• Pidempään säilytettävät erät pakastetaan –20 °C:ssa tai kylmemmässä, ja jokainen erä sulatetaan vain kerran.
• Kirjaa liuotin, pitoisuus, liuotuspäivä ja säilytyslämpötila. Ilman näitä neljää tietoa myöhempää puhtaustulosta ei voi tulkita.

Liuottimen valinta vaikuttaa stabiiliuteen, koska liuottimien pH ja säilöntäaineet eroavat. Kahta yleisintä vaihtoehtoa verrataan artikkelissa bakteriostaattinen vesi vai etikkahappo, ja itse liuottaminen käydään läpi oppaassa peptidin liuottaminen vaihe vaiheelta.

Miten liuottimet säilytetään?

Liuottimet säilytetään eri tavalla kuin peptidit. Bakteriostaattinen vesi ja etikkahappo 0,6 % säilytetään tuotetietojen mukaan huoneenlämmössä (15–25 °C) ja suojattuna kontaminaatiolta. Bakteriostaattisen veden säilöntäaine hidastaa bakteerien kasvua, kun pulloa käytetään useammin kuin kerran. Etikkahappo on mieto happo, jota käsitellään tavanomaisella laboratoriohuolellisuudella.

Sopiiko huurteeton pakastin peptideille?

Pitkäaikaiseen säilytykseen huurteeton pakastin ei ole paras valinta. Se tekee sulatusjaksoja, joiden aikana lämpötila nousee tarkoituksella hetkeksi. Peptideille tämä on toistuvaa lämpötilan vaihtelua. Käsin sulatettava pakastin pitää lämpötilan tasaisempana. Kirjaa myös pakastimen lämpötilapoikkeamat, esimerkiksi sähkökatkot.

Miten säilytys dokumentoidaan?

• Kirjaa vastaanotettaessa paketin kunto ja se, oliko kylmäpakkaus ehjä.
• Säilytä analyysitodistus samassa kansiossa eränumeron kanssa, jotta puhtaus on aina luettavissa säilytyshistorian rinnalla.
• Merkitse jokaiseen pulloon ja liuoserään yhdiste, pitoisuus, liuotin ja päivämäärä.

Puhtausluku on mielekäs vain tiettyyn analyysimenetelmään ja ajankohtaan sidottuna. Analyysitodistuksen lukemisesta kerrotaan oppaassa näin luet peptidin puhtaustodistuksen.

Peptidien säilytys lyhyesti

• Stabiiliudella on kemiallinen ja fysikaalinen puoli, ja näyte voi epäonnistua toisessa vaikka läpäisee toisen.
• Kylmäkuivattu tila on selvästi liuosta kestävämpi.
• Lämpötila, kosteus, valo sekä jäädytys ja sulatus ovat tärkeimmät hajottavat tekijät.
• Liuokset ovat lyhytikäisiä työliuoksia. Erissä säilyttäminen ja huolellinen kirjanpito tekevät tuloksista tulkittavia.

Usein kysytyt kysymykset

Kuinka kauan kylmäkuivattu peptidi säilyy?

Se riippuu sekvenssistä, valmisteesta ja olosuhteista. Julkaistuissa stabiiliusohjelmissa kylmäkuivattujen valmisteiden on raportoitu säilyneen 12–24 kuukautta 2–8 °C:ssa, mutta oman erän analyysitodistus on aina ensisijainen ohje.

Mistä tietää, onko peptidi hajonnut?

Silmämääräisesti värimuutos, paakkuuntuminen tai sameus liuoksessa antavat vihjeen. Varma tieto saadaan vain analyysilla, esimerkiksi toistamalla HPLC-puhtausmittaus ja vertaamalla sitä erän analyysitodistukseen.

Voiko peptidin säilyttää huoneenlämmössä?

Kylmäkuivattu peptidi kestää yleensä lyhyitä jaksoja, esimerkiksi kuljetuksen. Varsinainen säilytys tehdään kylmässä analyysitodistuksen ohjeen mukaan.

Voiko liuotetun peptidin pakastaa?

Voi, kun liuos jaetaan ensin kertakäyttöisiin eriin. Jokainen erä sulatetaan vain kerran.

Missä lämpötilassa liuotettu peptidi säilytetään?

Lyhytaikaisesti jääkaapissa 2–8 °C:ssa ja valolta suojattuna. Pidempään säilytykseen liuos jaetaan erissä pakastimeen –20 °C:seen tai kylmempään.

Miksi pullon pitää antaa lämmetä ennen avaamista?

Kylmän pullon sisään tiivistyy ilman kosteutta, ja kosteus kiihdyttää jauheen hajoamista.

Vain tutkimuskäyttöön. Ei tarkoitettu ihmisten tai eläinten nautittavaksi.