Čuvanje peptida: kako čuvati liofilizirane peptide u laboratoriju

Ukratko: Za čuvanje peptida vrijedi pravilo: suho, zatvoreno, tamno i hladno. Liofilizirani prah drži se na 2 do 8 °C za redovitu uporabu, a na −20 °C ili hladnije za dulje razdoblje. Otopljeni peptid znatno je manje stabilan, pa se drži u hladnjaku kao kratkotrajna radna otopina ili se dijeli u alikvote i zamrzava.

Uvjeti čuvanja najmanje su zanimljiva, ali jedna od najčešćih varijabli zbog kojih se rezultati ne mogu ponoviti. Bočica koja je prošla toplu dostavu, zamrzivač s automatskim odmrzavanjem ili šest mjeseci na stolu pod svjetlom nije kemijski ista kao bočica opisana na certifikatu analize. U ovom vodiču objašnjavamo što literatura o stabilnosti kaže i kako laboratoriji te uvjete kontroliraju.

Što znači stabilnost peptida?

Stabilnost nije jedno svojstvo, nego dva pitanja koja se mjere odvojeno:

• kemijska stabilnost: je li kovalentna struktura netaknuta, odnosno je li sekvenca promijenjena hidrolizom, oksidacijom, deamidacijom ili premještanjem disulfidnih veza
• fizička stabilnost: postoji li molekula još u željenom stanju, bez nakupljanja (agregacije), vezanja na stijenke posude, taloženja ili urušavanja liofilizata

Ta dva svojstva mogu se razići. Uzorak može proći provjeru identiteta masenom spektrometrijom, a da se znatan dio već nakupio i više nije dostupan u otopini. Zato studije stabilnosti uz HPLC čistoću koriste i metode koje mjere veličinu čestica.

Čuvanje peptida: što najviše utječe na stabilnost?

Literatura o formulacijama dosljedno navodi istih nekoliko čimbenika:

• temperatura: brzina razgradnje naglo raste s toplinom, zbog čega se ubrzana ispitivanja stabilnosti rade na povišenoj temperaturi
• voda: hidroliza i deamidacija trebaju vodu, pa se ostatna vlaga u liofilizatu redovito prati
• svjetlo: fotorazgradnja osušenih peptidnih formulacija dokumentirana je, a sekundarno neprozirno pakiranje ju je suzbijalo
• sastav sekvence: metionin, cistein i triptofan skloni su oksidaciji, a motivi asparagin-glicin deamidaciji
• pH i pufer: stabilnost otopljenog peptida snažno ovisi o pH-u
• pomoćne tvari: šećeri poput trehaloze, saharoze i manitola istražuju se kao zaštitne tvari koje čuvaju strukturu tijekom liofilizacije i čuvanja
• zamrzavanje i odmrzavanje: stvaranje leda potiče agregaciju na granicama faza

Primjer osjetljive sekvence je MOTS-c, peptid podrijetlom iz mitohondrija čija sekvenca MRWQEMGYIFYPRKLER sadrži dva metionina i triptofan, dakle ostatke sklone oksidaciji. Kod takvih peptida zaštita od zraka i svjetla posebno je važna.

Kako čuvati liofilizirane peptide?

Liofilizirano stanje daleko je otpornije od otopine. Objavljeni programi stabilnosti na liofiliziranim formulacijama peptida i proteina izvještavaju o očuvanoj cjelovitosti tijekom 12 do 24 mjeseca na 2 do 8 °C, uz kraće razdoblje na sobnoj temperaturi. Mjerodavni su ipak uvjeti i datum ponovnog ispitivanja navedeni na COA za konkretnu seriju.

1. Temperatura: 2 do 8 °C za kraće razdoblje, −20 °C ili hladnije za dugotrajno čuvanje.
2. Svjetlo: bočice držite u vanjskoj kutiji ili neprozirnoj posudi.
3. Zatvarač: ne otvarajte bočicu dok materijal nije potreban. Neoštećen čep glavna je zapreka vlazi i kisiku.
4. Prije otvaranja: pustite da se zatvorena bočica ugrije na sobnu temperaturu. Otvaranje hladne bočice uvlači vlažan zrak, a kondenzacija unosi upravo onu vodu koju suho čuvanje treba isključiti.

TB-500 je dobar primjer: isporučujemo ga kao liofilizirani prah, 10 mg u staklenoj bočici, s preporukom čuvanja na 2 do 8 °C, zaštićen od svjetla. Isti uvjeti navedeni su i za MOTS-c 10 mg.

Koliko je stabilna otopina peptida?

Kad se peptid otopi, voda izravno sudjeluje u glavnim putovima razgradnje, a otopljene molekule mogu se nakupljati i vezati za stijenke posude. Zato se otopine smatraju kratkotrajnim radnim otopinama.

• otopinu držite u hladnjaku, zaštićenu od svjetla
• podijelite je u alikvote umjesto da istu bočicu otvarate iznova; tako ograničavate i zamrzavanje i izloženost zraku
• zabilježite otapalo, koncentraciju, datum pripreme i temperaturu čuvanja; bez ta četiri podatka kasniji rezultat čistoće ne možete protumačiti

Izbor otapala također utječe na stabilnost jer se otapala razlikuju po pH-u i konzervansu. Bakteriostatska voda sadrži 0,9 % benzilnog alkohola koji koči rast bakterija pri višekratnom uzimanju iz bočice. Sama se čuva na sobnoj temperaturi, od 15 do 25 °C, zaštićena od onečišćenja. Usporedbu otapala donosimo u članku kako rekonstituirati peptide.

Smije li se peptid zamrzavati više puta?

Bolje ne. Ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje standardni je stresni uvjet u studijama formulacija, jer led stvara granične površine koje potiču agregaciju i koncentrira otopljene tvari u preostaloj tekućini. Laboratoriji zato rade s alikvotima za jednokratnu uporabu.

Pazite i na vrstu zamrzivača. Zamrzivač s automatskim odmrzavanjem namjerno mijenja temperaturu, pa za dugotrajno čuvanje nije jednak uređaju s ručnim odmrzavanjem.

Kontrolni popis za čuvanje peptida

Oblik	Temperatura	Na što paziti
liofilizirani prah, kraće razdoblje	2 do 8 °C	zatvoreno, tamno, suho
liofilizirani prah, dugotrajno	−20 °C ili hladnije	bez čestog otvaranja, ugrijati prije otvaranja
otopina, radna	2 do 8 °C	kratak rok, oznaka s datumom
otopina, dulje čuvanje	alikvoti na −20 °C	bez ponovljenog zamrzavanja
bakteriostatska voda	15 do 25 °C	zaštita od onečišćenja

Koju evidenciju voditi?

• stanje pošiljke pri primitku
• broj serije, HPLC čistoću, udio peptida i vlagu s certifikata analize
• COA uz zapis o seriji, tako da se čistoća uvijek čita zajedno s poviješću čuvanja
• svako odstupanje temperature u zamrzivaču

Kako čitati COA, objašnjavamo u članku čistoća peptida i COA certifikat. Svaki naš proizvod neovisni laboratorij provjerava HPLC-om i masenom spektrometrijom na čistoću od najmanje 99 %, a COA postoji za svaku seriju. Šaljemo iz EU-a, diskretno i s praćenjem, a plaćate karticom, Google Payem ili kriptovalutama. Otapala i pribor naći ćete u kategoriji istraživačke kemikalije i laboratorijski pribor.

Zašto podaci o stabilnosti ne govore ništa o primjeni?

Istraživački peptidi u EU isporučuju se kao laboratorijski reagensi, a ne kao odobreni lijekovi. Podaci o stabilnosti služe ponovljivosti pokusa i kontroli kvalitete reagensa. Ne dokazuju da je pripravak prikladan za primjenu na bilo kojem živom organizmu, i nijedan spoj spomenut u ovom članku nije odobren lijek.

Česta pitanja o čuvanju peptida

Koliko dugo traju liofilizirani peptidi?

Ovisi o sekvenci, formulaciji i uvjetima. Studije na liofiliziranim formulacijama izvještavaju o 12 do 24 mjeseca na 2 do 8 °C, a mjerodavni su podaci s COA za seriju.

Zašto su peptidi manje stabilni kad se otope?

Jer voda sudjeluje u hidrolizi i deamidaciji, a otopljene molekule mogu se nakupljati i vezati za stijenke.

Moraju li peptidi u hladnjak?

Za redovito čuvanje da, na 2 do 8 °C i zaštićeni od svjetla. Za dulje razdoblje laboratoriji ih zamrzavaju na −20 °C ili hladnije.

Zašto bočicu treba ugrijati prije otvaranja?

Jer se na hladnom prahu odmah skuplja kondenzacija, a vlaga ubrzava razgradnju.

Samo za istraživačku uporabu. Nije za ljudsku ni životinjsku konzumaciju.