Per ricostituire un peptide liofilizzato si aggiunge un volume misurato di solvente, di solito acqua batteriostatica, facendolo scendere lungo la parete della fiala, e si lascia sciogliere la polvere senza agitare. La concentrazione finale si calcola dividendo la massa del peptide per il volume di solvente: 10 mg in 2 ml danno 5 mg/ml. Questa guida spiega come ricostituire peptidi in laboratorio passo per passo, quale solvente scegliere e come fare i calcoli.
Ricostituire significa riportare in soluzione una polvere liofilizzata, cioè essiccata a freddo, aggiungendo una quantità nota di solvente. Il risultato è una soluzione a concentrazione conosciuta, pronta per essere divisa in aliquote e usata in laboratorio.
La polvere spesso è appena visibile: una pellicola sottile sul fondo della fiala. È normale. In questa fase contano due cose: la solubilità, cioè se il peptide si scioglie del tutto, e la stabilità, cioè se resta integro una volta in soluzione.
Il primo riferimento è sempre la scheda del peptide o il suo certificato di analisi, che può indicare acqua, acqua batteriostatica o un acido diluito. In assenza di indicazioni particolari, la scelta è tra due solventi.
Acqua batteriostatica: acqua sterile con lo 0,9% di alcol benzilico come conservante, che inibisce la crescita dei batteri. Ha un pH vicino alla neutralità, è compatibile con la maggior parte dei peptidi e permette di prelevare più volte dalla stessa fiala con un rischio di contaminazione più basso dell'acqua semplice. È la scelta predefinita per i peptidi che si sciolgono bene in acqua, come BPC-157.
Acido acetico 0,6%: una soluzione leggermente acida. Alcuni peptidi, soprattutto quelli "appiccicosi", inclini ad aggregarsi o poco solubili a pH neutro, si sciolgono meglio in ambiente acido. Si usa come aiuto alla solubilità quando la scheda lo indica, non come solvente di default.
Il confronto completo tra i due è in acqua batteriostatica o acido acetico.
La formula è una sola:
concentrazione (mg/ml) = massa del peptide (mg) ÷ volume di solvente (ml)
Esempio con una fiala di BPC-157 da 10 mg:
| Solvente aggiunto | Concentrazione | Peptide in 0,1 ml |
|---|---|---|
| 1 ml | 10 mg/ml | 1 mg (1000 µg) |
| 2 ml | 5 mg/ml | 0,5 mg (500 µg) |
| 2,5 ml | 4 mg/ml | 0,4 mg (400 µg) |
| 5 ml | 2 mg/ml | 0,2 mg (200 µg) |
Il calcolo funziona anche al contrario. Per sapere quanto solvente serve si divide la massa per la concentrazione desiderata: per ottenere 4 mg/ml da 10 mg servono 10 ÷ 4 = 2,5 ml.
E per sapere quale volume prelevare per un'aliquota: volume (ml) = quantità desiderata (mg) ÷ concentrazione (mg/ml). Da una soluzione a 5 mg/ml, un'aliquota da 0,25 mg corrisponde a 0,05 ml, cioè 50 µl. Un trucco utile: 1 mg/ml equivale a 1 µg/µl, quindi a 5 mg/ml ogni microlitro contiene 5 µg.
I calcoli si basano sulla massa indicata in etichetta. Una polvere liofilizzata, però, contiene anche acqua, sali e controioni rimasti dalla purificazione, che non compaiono nella purezza misurata in HPLC. Il contenuto effettivo di peptide può quindi essere più basso della massa nominale.
Per lavori quantitativi conviene controllare se il certificato di analisi riporta il contenuto di peptide oltre alla purezza. La differenza tra i due valori è spiegata in come leggere il certificato di analisi di un peptide.
Non esiste un valore valido per tutti. In soluzione un peptide è molto meno stabile che da secco, perché l'acqua partecipa alle principali reazioni di degradazione, come l'idrolisi. Per questo la soluzione si tratta come una scorta di lavoro a breve termine: frigorifero, riparo dalla luce, aliquote monouso. Il riferimento resta la documentazione del lotto. Le regole per la polvere secca sono in come conservare i peptidi liofilizzati.
L'acqua batteriostatica PureChems arriva in fiala di vetro da 10 ml con chiusura sterile, l'acido acetico 0,6% in fiala sterile da 10 ml; entrambi si conservano a 15-25 °C, al riparo da contaminazioni. Tutti i prodotti hanno purezza ≥99% verificata in HPLC e spettrometria di massa da un laboratorio terzo e un certificato di analisi per ogni lotto. La spedizione parte dall'interno dell'UE, tracciata e discreta; si paga con carta, Google Pay o criptovalute.
Dipende dalla concentrazione voluta: con 2 ml si ottengono 5 mg/ml, con 1 ml 10 mg/ml.
Alcuni peptidi la prevedono, ma senza conservante non protegge dalla crescita batterica quando si preleva più volte dalla stessa fiala.
Quando la scheda lo indica, di solito per peptidi poco solubili a pH neutro o inclini ad aggregarsi.
Perché lo stress meccanico può danneggiare le catene peptidiche. Basta ruotarla piano o lasciarla riposare.
Che il peptide non si è sciolto del tutto. Va ricontrollato il solvente indicato nella scheda.
Solo per uso di ricerca. Non destinato al consumo umano o animale.
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