Resposta curta: na pureza de péptidos por HPLC, o número indica que percentagem da área do cromatograma corresponde ao péptido-alvo, medida a um comprimento de onda definido. A espectrometria de massa não mede a pureza: confirma a identidade, comparando a massa observada com a massa teórica da molécula. Juntas, num Certificado de Análise (COA) com o número de lote certo, dão uma imagem fiável do que está dentro do frasco.
O COA é o documento mais informativo que acompanha um péptido de investigação e, ao mesmo tempo, um dos mais mal lidos. Um "99% de pureza" tem pesos muito diferentes consoante o método que o produziu, a forma como esse método foi aplicado e aquilo que constitui o 1% restante. Este artigo explica o que medem a HPLC e a espectrometria de massa, o que fica de fora e que perguntas fazer a qualquer COA.
A HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) separa os componentes de uma amostra à medida que passam por uma coluna. Nos péptidos usa-se quase sempre a HPLC de fase reversa. Cada componente sai da coluna num momento diferente e aparece como um pico no cromatograma.
A pureza é calculada como a área do pico do péptido-alvo a dividir pela área total dos picos integrados. O resultado é uma percentagem de área, medida a um comprimento de onda indicado, normalmente 214 nm, que corresponde à ligação peptídica, ou 220 nm.
Porque as impurezas que absorvem pouco a esse comprimento de onda ficam sub-representadas na integração. Um COA que não indica o comprimento de onda deixa uma pergunta sem resposta.
Significa que, no cromatograma, o pico do péptido-alvo representa 99% da área total integrada das espécies detetadas por esse método. Não significa que 99% da massa do frasco seja péptido. A água, os sais e os contraiões não são detetados por este método.
A espectrometria de massa estabelece a identidade. Compara a massa observada com a massa teórica calculada a partir da fórmula. Se coincidem, a molécula certa está presente.
Um exemplo do catálogo: o GHK-Cu é o complexo de cobre(II) da glicil-L-histidil-L-lisina, com a fórmula C14H24CuN6O4 e uma massa molecular de 340,9 g/mol. A espectrometria de massa verifica que a massa observada corresponde a esse valor, incluindo o cobre.
O que a espectrometria de massa não faz, por si só, é quantificar quanto há de tudo o resto. Os trabalhos de caracterização publicados mostram o mesmo princípio vezes sem conta: um único método raramente estabelece ao mesmo tempo a identidade e a pureza. É por isso que se usam métodos ortogonais, isto é, métodos que medem coisas diferentes, como a HPLC combinada com a espectrometria de massa e, em análises mais aprofundadas, a ressonância magnética nuclear quantitativa ou a eletroforese capilar.
Esta é a confusão mais frequente. A pureza cromatográfica diz que fração do material peptídico detetado é o péptido certo. O conteúdo de péptido diz que fração da massa seca total do frasco é péptido.
Um péptido sintético liofilizado raramente é só péptido. O pó contém também água absorvida durante o manuseamento, sais residuais e contraiões da purificação. O ácido trifluoroacético é o aditivo habitual na purificação por fase reversa e fica associado aos resíduos básicos do péptido final; por vezes é trocado por acetato. Assim, um lote pode ter 99% de pureza por HPLC e o péptido representar uma parte menor do peso da balança. Os dois números são legítimos, só respondem a perguntas diferentes.
A sequência determina o risco. O Semax (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), fornecido como pó liofilizado de 10 mg, contém metionina, que é sensível à oxidação. Num cromatograma, uma forma oxidada surge como um pico separado. Por isso a pureza medida à saída do laboratório só se mantém com bom armazenamento, tema do guia como armazenar péptidos.
| Método | O que mede | O que não mede |
|---|---|---|
| HPLC de fase reversa | Fração do material peptídico detetado que é o péptido-alvo | Água, sais, contraiões, identidade da molécula |
| Espectrometria de massa | Identidade: massa observada contra massa teórica | Quantidade de impurezas |
| Karl Fischer | Teor de água | Pureza ou identidade |
| Análise de azoto ou de aminoácidos | Conteúdo de péptido na massa total | Impurezas peptídicas |
Um COA sem número de lote não se consegue associar ao material que está na bancada. Um COA só com tabela, sem traçados, impede uma avaliação independente da forma dos picos, da linha de base e da integração. Nenhum dos dois prova um problema, mas ambos reduzem o documento a uma afirmação. O artigo sobre como ler o certificado de análise aprofunda cada campo.
Cada lote da PureChems é analisado por HPLC e espectrometria de massa num laboratório independente, com pureza igual ou superior a 99%, e tem o seu próprio COA. O GHK-Cu é fornecido como pó liofilizado de 100 mg e o Semax como pó liofilizado de 10 mg, ambos a guardar entre 2 e 8 °C e protegidos da luz. Para ver como estes números se aplicam a compostos concretos, o artigo Noopept vs Semax compara um dipéptido robusto com um péptido sensível à oxidação.
Um ponto final importante: o COA documenta as propriedades analíticas de um lote de reagente. Não diz nada sobre a adequação do material para administração a qualquer ser vivo. Pureza e segurança são conceitos distintos.
Que o pico do péptido-alvo representa 99% da área integrada no cromatograma de HPLC, ao comprimento de onda indicado. Não quer dizer que 99% da massa do frasco seja péptido.
A pureza compara o péptido-alvo com as outras espécies peptídicas detetadas. O conteúdo compara o péptido com a massa total, que inclui água, sais e contraiões.
Não. Confirma a identidade da molécula. A pureza vem da HPLC.
Um COA sem lote não tem rastreabilidade e não pode ser associado ao frasco concreto. Deve tratar-se como uma afirmação, não como prova analítica.
Apenas para fins de investigação. Não destinado a consumo humano ou animal.
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